草莓病毒分子檢測及其部分基因組序列分析.pdf

1、Y762183分類號韭點!』密級——博士學位論文草莓病毒分子檢測及其部分基因組序列分析楊洪一指導教師姓名————韭盎塞——堂盛L—一!噬武教援匡量型越援沈田盤些盍堂固藝堂瞳申請學蝴泓。越，。、專業(yè)名稱二—璺撾堂——一≤要茹≥蓍舸≥盤至i畜疊目語文替辯日期墊業(yè)生目目學位授予單位和日期—鹽壓籃些盍堂——當塑芏L丘』!芝一答辯委員會主席衛(wèi)耍塹j乳_控評聞人皿量塹j盟—撞韭丑查班宜雖昱亙望熬握昌塑耍熬援沈陽農(nóng)業(yè)大學二00五年六月摘要草莓是無性繁

2、殖的多年生草本植物，受多種病毒的侵染，病毒嚴重危害草莓生產(chǎn)。本論文旨在探索建立草莓幾種主要病毒的分子檢測技術體系，同時對病毒的部分基因組序列進行分析。1草莓的核酸提取是進行草莓分子生物學研究的難點。對不同核酸分離方法進行了研究，結(jié)果表明硅捕獲法、改進的硅捕獲法、Trizot法、PEX法、Release—IT法及上海生工、VGene、Invitrogen公司的RNA提取試劑盒未能從草莓中分離出高質(zhì)量的RNA。先利用磷酸鹽緩沖溶液研磨葉片，

3、再利用Qiagen試劑盒提取，可以有效地提取出草莓總RNA。而以CTAB緩沖液裂解組織，結(jié)合LiCI沉淀、酚／氯仿抽提，從草莓野生資源、栽培品種、昆諾藜中都可以提取出RNA，并可以穩(wěn)定地進行ImPCR、多重R1二PCR、NASBA反應。2建立了SMoV：SMYEV、SVBV的R1二PCR檢測體系。利用嵌套PCR對SMoV進行了檢測，即首先利用第一對引物在低的退火溫度下擴增20個循環(huán)，再利用第二對引物在高的退火溫度下擴增，比常規(guī)RTPCR

4、提高靈敏度20倍左右。首次應用轉(zhuǎn)錄增強技術檢測SMoV，比常規(guī)RTPCR提高靈敏度60倍左右。首次利用NASBA技術對SMoV迸行檢測，引物在SMoV基因組中位置同RTPCR引物相同，40℃反應120min，檢測結(jié)果與R■PCR一致。3在利用常規(guī)RTPCR擴增SMoV、SMYEV和利用嵌套PCR擴增SMoV的研究中，試管苗都比田間苗有更低的檢測下限，意味著試管苗的病毒含量比罔間苗商。4為了監(jiān)測RNA的質(zhì)量和RTPCR的有效性，線粒體NA