草莓鑲脈病毒侵染性克隆的構(gòu)建及其ORFVI基因的原核表達(dá).pdf

1、草莓鑲脈病毒(Strawberryveinbandingvirus,SVBV)是一種嚴(yán)重危害草莓的潛隱性病毒,在全世界范圍內(nèi)廣泛分布,目前,SVBV在我國河南、河北、吉林等省都有報道,給我國草莓生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。SVBV屬于花椰菜花葉病毒科花椰菜花葉病毒屬,基因組為雙鏈環(huán)狀DNA,大小約為7.8kb,含有7個ORFs。為了深入研究SVBV在寄主體內(nèi)的復(fù)制、移動以及病毒致病因子與寄主因子的相互關(guān)系,本研究構(gòu)建了SVBV的侵染性克隆。另外,

2、SVBV的致病性強(qiáng)弱與其ORFVI基因編碼的P6蛋白密切相關(guān),本研究克隆了SVBV的ORFVI基因并進(jìn)行原核表達(dá),制備出特異性抗血清,可為深入研究P6蛋白的具體功能奠定基礎(chǔ),對闡明病毒在寄主體內(nèi)的致病機(jī)制具有重要意義。
　　1.SVBV侵染性克隆的構(gòu)建
　　SVBV基因組全長7.8kb,pSVBV-E3為SVBV全基因組克隆,SVBV含有EcoRI和BamHI兩個單酶切位點,首先利用EcoRI和BamHI雙酶切pSVBV-E

3、3,獲得約4kb的0.5拷貝SVBV(0.5SVBV),將0.5SVBV插入到同樣酶切的雙元表達(dá)載體pBinPLUS,獲得重組載體pBin-0.5SVBV。然后EcoRI單酶切pSVBV-E3,獲得1拷貝的SVBV全長序列,將其正向插入到EcoRI酶切的pBin-0.5SVBV中,獲得重組載體pBin-1.5SVBV。
　　2.SVBV侵染性克隆的轉(zhuǎn)化、接種和檢測
　　將重組質(zhì)粒pBin-1.5SVBV電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV31

4、01,篩選陽性克隆。農(nóng)桿菌浸潤法接種本氏煙(Nicotianabenthamiana)、三生煙(N.tabacumvar.SamsunNN)、心葉煙(N.glutinosa)和森林草莓(Fragariavesca);另外,利用基因槍法將重組質(zhì)粒pBin-1.5SVBV轉(zhuǎn)入森林草莓和本氏煙。浸潤接種及基因槍轟擊20天后觀察,4種植物均沒有表現(xiàn)出任何特異性癥狀。提取各植物新長出的系統(tǒng)葉片基因組DNA,PCR檢測SVBV基因特異性片段,發(fā)現(xiàn)能

5、夠在本氏煙、三生煙和心葉煙上系統(tǒng)葉中檢測出SVBV,而利用基因槍轟擊的草莓和本氏煙新生長的系統(tǒng)葉中檢測不到SVBV。
　　3.SVBVORFVI基因編碼P6蛋白的表達(dá)和純化及抗血清制備
　　PCR擴(kuò)增SVBVORFVI基因,插入原核表達(dá)載體pET-SUMO獲得重組質(zhì)粒pET-SUMO-ORFVI。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)與Ni2+-NTA親和柱純化,獲得分子質(zhì)量約為90kD的重組蛋白。以純化的重組蛋白為