蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究斑馬魚腦組織和肝細(xì)胞響應(yīng)甲基對硫磷脅迫的關(guān)鍵蛋白質(zhì).pdf

1、甲基對硫磷(Methyl parathion，MP)由于具有藥效高、品種防治對象多等特點，成為全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中使用最為廣泛的一類有機(jī)磷殺蟲劑。然而，過去幾十年來MP的過度使用，加之其本身的環(huán)境持久性，已造成其在水環(huán)境中的高濃度殘留，對水生生物的生存以及人類健康構(gòu)成了巨大威脅。目前，已有大量關(guān)于MP生物毒性的研究報道，然而對于MP產(chǎn)生這些毒性的分子機(jī)制還不是很清楚。因此，本論文以MP為有機(jī)磷污染物，研究了MP對斑馬魚腦組織和肝(ZFL)

2、細(xì)胞的毒性效應(yīng)，繼而采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究在MP脅迫下斑馬魚腦組織和ZFL細(xì)胞表達(dá)的差異蛋白，篩選出響應(yīng)MP毒性的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，并從分子水平上初步探索MP的毒理機(jī)制。
　　 采用氣相色譜法分析MP在斑馬魚腦組織中的殘留量及其代謝產(chǎn)物。結(jié)果表明MP可迅速在腦組織中積累，而后經(jīng)歷緩慢的清除過程；其主要的代謝產(chǎn)物為對硝基苯酚。與其它有機(jī)磷農(nóng)藥的毒性類似，MP可顯著抑制乙酰膽堿酯酶(AChE)的活性，并且其活性下降趨勢呈典型的劑量-時間效

3、應(yīng)。兩種抗氧化酶過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性變化表現(xiàn)為抑制-激活-抑制，而脂質(zhì)過氧化物丙二醛(MDA)的含量變化趨勢正好與之相反，呈升高-降低-升高。說明MP對斑馬魚產(chǎn)生了氧化脅迫，CAT、SOD活性的激活過程則體現(xiàn)了機(jī)體在一定程度上抵抗氧化脅迫的自我保護(hù)機(jī)制。
　　 運用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分析了MP脅迫下斑馬魚腦組織全蛋白質(zhì)組表達(dá)的差異蛋白質(zhì)。與對照組相比，僅發(fā)現(xiàn)6個蛋白差異表達(dá)。其中，4個蛋白(TU

4、BB5、CKBB、DPYSL3、GFAP)表達(dá)量下調(diào)，2個蛋白(HNRPDL、class1 beta tubulin)表達(dá)量上調(diào)，該結(jié)果顯然不利于我們?nèi)娴卣J(rèn)識MP的毒理學(xué)機(jī)制。膜蛋白在生物體中負(fù)責(zé)執(zhí)行許多重要功能，并且是多數(shù)毒物作用的靶點。因此，膜蛋白可能是MP的主要作用目標(biāo)。有鑒于此，我們進(jìn)一步采用膜蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究MP脅迫下斑馬魚腦組織膜蛋白的差異表達(dá)情況，結(jié)果篩選出16個差異膜蛋白(8個表達(dá)量上調(diào)，8個表達(dá)量下調(diào))。這些膜蛋白

5、的功能涉及氧化還原平衡(PDIA3、ALDH5Al)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(GNB1L、GNB2、GDI2)、代謝(DLST、IDH3A、MDH)、蛋白質(zhì)合成與降解(TUFM、UCHL1)及神經(jīng)發(fā)育與功能(ependymin、STXBP1)等多個方面。
　　 與組織水平相比，基于細(xì)胞水平的毒理學(xué)研究更有利于了解毒物毒性作用的信號通路并揭示其毒理機(jī)制。因此，本研究以ZFL細(xì)胞為研究對象，分析了MP對ZFL細(xì)胞的毒性作用，并采用膜蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

6、研究MP暴露后ZFL細(xì)胞表達(dá)的差異膜蛋白，其結(jié)果可為今后深入研究MP的分子毒理機(jī)制提供一定的科學(xué)依據(jù)。
　　 細(xì)胞形態(tài)顯微觀察、MTT法等研究結(jié)果表明，MP顯著抑制ZFL細(xì)胞的增殖，且抑制率與MP濃度成正相關(guān)，其24h IC50為200μM。PI單染法和AnnexinV-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果揭示了MP可使ZFL細(xì)胞周期阻滯于S期，且MP導(dǎo)致ZFL細(xì)胞死亡的主要原因是誘導(dǎo)細(xì)胞的繼發(fā)性壞死或晚期凋亡，而不是早期凋亡

7、。膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在MP脅迫下ZFL細(xì)胞中8個膜蛋白的表達(dá)水平發(fā)生改變，其中6個表達(dá)量上調(diào)的蛋白為endoplasmin、HSP9、CD146、SDH、arginase-2、ACBD5A，2個表達(dá)量下調(diào)的蛋白為TUBA2和TRHR1L。對這些差異蛋白進(jìn)行功能分類，可分為分子伴侶、細(xì)胞骨架、代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)運和受體等。
　　 本研究通過藥物殘留及代謝產(chǎn)物測定、酶學(xué)測定、MTT法、流式細(xì)胞術(shù)等多種手段，分析了MP對斑馬魚腦組

8、織和ZFL細(xì)胞的毒性效應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，采用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出斑馬魚腦組織和ZFL細(xì)胞響應(yīng)MP脅迫的差異蛋白質(zhì)。選用Western blotting分析MP脅迫前后DPYSL3、STXBP1和arginase-2的蛋白表達(dá)水平及quantitative real-time PCR分析蛋白相應(yīng)的mRNA水平，結(jié)果再次驗證了這些蛋白的差異表達(dá)，提高了選用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選與鑒定MP誘導(dǎo)的差異蛋白質(zhì)的可信度。利用生物信息學(xué)手段對所有差異蛋