蛋白質(zhì)組化

1、蛋白質(zhì)組化這個概念最早是在1995年提出的，它在本質(zhì)上指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生，細(xì)胞代謝等過程的整體而全面的認(rèn)識。目前，在蛋白質(zhì)功能方面的研究是極其缺乏的。大部分通過基因組測序而新發(fā)現(xiàn)的基因編碼的蛋白質(zhì)的功能都是未知的，而對那些已知功能的蛋白而言，它們的功能也大多是通過同源基因功能類推等方法推測出來的。有人預(yù)測，人類基因組編碼的蛋白

2、至少有一半是功能未知的。因此，在未來的幾年內(nèi)，隨著至少30種生物的基因組測序工作的完成，人們研究的重點必將轉(zhuǎn)到蛋白質(zhì)功能方面，而蛋白質(zhì)組的研究正可以完成這樣的目標(biāo)。在蛋白質(zhì)組的具體應(yīng)用方面，蛋白質(zhì)在疾病中的重要作用使得蛋白質(zhì)組學(xué)在人類疾病的研究中有著極為重要的價值。疾病的產(chǎn)生可能僅僅是因為基因組中一個堿基對的變化，如β血紅蛋白第六位上的Glu變?yōu)閂al就導(dǎo)致了鐮刀型細(xì)胞貧血癥的發(fā)生。然而，對于大多數(shù)疾病來說，其疾病發(fā)生機制要復(fù)雜的多。因

3、此，對于疾病發(fā)生的分子機制的認(rèn)識就需要一些能夠解決這些復(fù)雜性的方法來完成。而作為細(xì)胞中的活性大分子，蛋白質(zhì)無疑是與疾病相關(guān)的主要分子，蛋白表達(dá)水平的改變是與疾病，藥物作用或毒素作用直接相關(guān)的。因此，基于蛋白質(zhì)整體水平的蛋白質(zhì)組學(xué)在人類疾病研究中無疑將發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)在，蛋白質(zhì)組學(xué)在人類疾病中的應(yīng)用已經(jīng)在一些疾病如皮膚病，癌癥，心臟病中廣泛開展了，而這些研究則主要集中在這樣幾個方面：尋找和疾病相關(guān)的單個蛋白，整體研究某種疾病引起的蛋白表達(dá)

4、或修飾的變化，利用蛋白質(zhì)組尋找一些致病微生物引起的疾病的診斷標(biāo)記和疫苗等。下面，我們就將就蛋白質(zhì)組學(xué)的基本技術(shù)和這些領(lǐng)域的應(yīng)用作一些介紹。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基本技術(shù)對于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究來說，它的最基本的實驗手段就是利用雙向凝膠電泳(twodimensionalproteinelectrophesis2DE)，在整個基因組水平上檢測蛋白質(zhì)表達(dá)的情況。雙向凝膠電泳首先利用等電點聚焦來分離不同等電點的蛋白，再利用SDS－PAGE來分離不同分子量

5、的蛋白，其分辨率是非常高的。微克級的蛋白質(zhì)就可以被很好的分辨開了，如在微克級水平上，有人從一個蛋白混合物中最多分開了11200種蛋白質(zhì)，數(shù)量是非?？捎^的。因而，微克級的蛋白的雙向凝膠電泳常被用來初步檢測表達(dá)或修飾有變化的蛋白。然后，同樣的蛋白混合物樣品可用于毫克級的2DE，這樣，電泳圖譜上的每一個多肽就可被純化并進(jìn)行下一步的分析，如質(zhì)譜，末端或中間的氨基酸序列分析等。僅僅進(jìn)行雙向凝膠電泳顯然是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，因為由雙向電泳得到的蛋白質(zhì)表達(dá)情

6、況的變化并不能和具體的何種蛋白表達(dá)出了變化聯(lián)系起來。而一些如蛋白質(zhì)印跡或凝集素親和印跡等傳統(tǒng)技術(shù)對于這方面的信息也幫助不大。為了鑒定這些由電泳得來的蛋白，質(zhì)譜(MS，massspectrometry)被廣泛應(yīng)用在蛋白質(zhì)組學(xué)中。對于蛋白質(zhì)的鑒定，有兩種方法用的最為廣泛，即MALDI－MS(matrixassistedlaserdesptionionization)和ESI－MS(electrosprayionization)。這兩種方法各

7、有自己的適用范圍，通常前者對于分析高分子量的蛋白更有效，而后者對于蛋白的檢測靈敏度更高，?？蛇_(dá)到飛克級水平以下。質(zhì)譜可以用于蛋白質(zhì)分析主要是因為它可以提供特定蛋白的不同方面的結(jié)構(gòu)信息，如它可直接測定蛋白或多肽的分子量信息，也可用來獲得一些蛋白質(zhì)序列信息等。同時，質(zhì)譜也可通過多肽片段分子量的改變來得到一些關(guān)于糖型，磷酸化和其它翻譯后修飾的數(shù)據(jù)。因此，質(zhì)譜對于蛋白質(zhì)的鑒定是非常重要的，而它的進(jìn)展也無疑會大大促進(jìn)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進(jìn)展。單個的疾

8、病相關(guān)蛋白的尋找這樣一種復(fù)雜的疾病來說，也不可能僅由一種致病機理造成。因此，對于這樣的疾病，從整體的蛋白質(zhì)組水平來研究是極為必要的。另外，相對其它組織而言，主要由心肌細(xì)胞組成的心臟是一種相對均一的組織，這也為用雙向凝膠電泳進(jìn)行蛋白質(zhì)組的研究提供了良好的基礎(chǔ)。對DCM的蛋白質(zhì)組的研究在九十年代初就已經(jīng)開始了，目前，心肌的雙向凝膠電泳的數(shù)據(jù)庫已經(jīng)建立。盡管國際上各實驗室之間的數(shù)據(jù)之間有著如不同的樣品制備，不同的等電聚焦條件，不同的凝膠大小等

9、差異，但這些數(shù)據(jù)的比較證明，在大多數(shù)情況下，不同蛋白的點的位置還是相對穩(wěn)定的，可以進(jìn)行大規(guī)模的比較研究。在Knecht等人的研究中，得到了一個高解析度的具有大約3300個心肌蛋白點的雙向電泳結(jié)果，并對其中的150個蛋白進(jìn)行了氨基酸分析，N端和中間的Edman降解以及MALDI－MS等一系列鑒定。而對幾百個正常和擴(kuò)張性心肌病的病人的2－DE結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，兩者的蛋白條帶具有可比性。除去一些可能由不同的疾病有關(guān)參數(shù)如患病程度，用藥情況，病人年

10、紀(jì)等因素造成的無重復(fù)性的點的多少和強度的變化外，患病者和正常人有25種蛋白在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著差異。這些即是DCM相關(guān)蛋白。而這個結(jié)果是在對幾百個樣品的大規(guī)模研究的基礎(chǔ)上得來的，而也只有大規(guī)模的研究，才能體現(xiàn)出這個結(jié)果在實際應(yīng)用前景上的價值。對于這幾十種疾病相關(guān)蛋白，我們可以用一些其它方法，如免疫組化，酶活測定等，來作進(jìn)一步的鑒定，確認(rèn)它們與疾病的相關(guān)性以及它們在疾病中的作用等。這些工作都是在基于蛋白質(zhì)組的研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步的深入而進(jìn)行的，

11、顯然，在幾百個DCM患者和正常對照的樣品的大規(guī)模水平上對疾病相關(guān)蛋白的整體研究無疑是最為基礎(chǔ)和有效的。病原微生物的蛋白質(zhì)組學(xué)分析近幾年來，關(guān)于傳染病的研究變得比原來更為重要。一些新的傳染原，如Breliaburgdferi，HIV，Ebola病毒等的出現(xiàn)，使得一些原來認(rèn)為已被控制的疾病如結(jié)核，多抗藥性的鏈球菌屬感染等又有所增加。因此，對于有毒力的微生物和病毒進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)的分析就顯得非常必要，它可以用來尋找和研究毒力因子，抗原，疫苗等，

12、而這些對于疾病的診斷，治療和防治是極為重要的。目前，已經(jīng)有18種微生物的基因組測序已經(jīng)完成，而另有60多種的微生物的基因組測序正在進(jìn)行當(dāng)中，這些基因序列的信息和相對真核組織來說少得多的基因數(shù)量都為蛋白質(zhì)組的研究提供了良好的基礎(chǔ)。疏螺旋體屬的Breliaburgdoferi是引起多系統(tǒng)疾病人類Lyme氏疏螺旋體病的主要致病因子。這種疾病的癥狀開始時常表現(xiàn)為一些環(huán)狀紅斑樣皮疹以及流感樣癥狀，發(fā)展下去也會造成一些神經(jīng)系統(tǒng)的并發(fā)癥和關(guān)節(jié)炎等。目

13、前，對這種疾病的診斷主要是通過臨床癥狀的判斷并輔以血清學(xué)實驗如ELISA，免疫印跡等來證實。由于這些實驗具有不同程度的敏感性和特異性，診斷并不是標(biāo)準(zhǔn)化的。利用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供一些新的較為標(biāo)準(zhǔn)的診斷標(biāo)記就顯得尤為必要了。Breliaburgdoferi的染色體上有853個基因，它的11個質(zhì)粒上有額外的430個基因。它的雙向凝膠電泳圖譜大約有300個點，由這些蛋白點就可以尋找免疫相關(guān)抗體等蛋白了。將銀染的Breliaburgdoferi

14、的2DE凝膠上的其中217個點編號后，用來源于兔子的多克隆抗體采用免疫雜交的方法鑒定了一些抗原在膠上的位置，如外表面蛋白A(OspA)，OspB，OspC，p83100，p39，flagellinp41等。除了p83100外，所有抗原在2DE圖上都存在于不只一個點上。利用不同表現(xiàn)癥狀的Lyme氏疏螺旋體病病人的血清與疏螺旋體的2DE圖進(jìn)行印跡分析發(fā)現(xiàn)，具有紅斑遷移癥狀的十個病人的血清中分別含有60種和88種抗原的IgM型和IgG型抗體，

15、而關(guān)節(jié)炎病人的血清中含有15種抗原的IgM抗體和76種不同抗原的IgG抗體，晚期神經(jīng)疏螺旋體病人的血清中則含有33種抗原的IgM抗體和76種抗原的IgG抗體，但在這三種不同疾病時期的病人血清中都含有這樣幾種抗原的抗體OspA，OspB，OspC，flagellin，p83100，p39等，這幾個抗原同時也是原來血清學(xué)實驗中用來診斷的標(biāo)記，蛋白質(zhì)組的結(jié)果驗證了原來診斷的合理性，同時，2DE的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)了一些原來并沒有發(fā)現(xiàn)的抗原，這些正是一