牛胚胎干細胞分離培養(yǎng)及鑒定.pdf

1、目的:
　　 建立牛胚胎干細胞的獲取、分離、培養(yǎng)體系，摸索牛ESCs的培養(yǎng)條件。為核移植的優(yōu)選供體細胞，用于提高牛的克隆和牛乳腺生物反應器研究的效率。
　　 方法:
　　 本試驗分為兩部分:一，飼養(yǎng)層的制備。飼養(yǎng)層包括牛骨髓充質(zhì)干細胞飼養(yǎng)層、牛乳腺干細胞飼養(yǎng)層和牛成纖維細胞飼養(yǎng)層。牛MSCs飼養(yǎng)層的制備采用:從屠宰場得到新鮮牛股骨，用注射器抽取骨髓間充質(zhì)干細胞，過濾離心，培養(yǎng)傳代，取第3代生長旺盛的牛MSCs，采

2、用絲裂霉素C處理，然后用磷酸緩沖液清洗后用做飼養(yǎng)層。牛MaSCs飼養(yǎng)層的制備采用:從屠宰場得到新鮮荷斯坦奶牛乳腺，酒精消毒，PBS清洗，剪成小塊，消化離心，接種培養(yǎng)，傳代，取第3代牛MaSCs用做飼養(yǎng)層。牛SFCs飼養(yǎng)層的制備采用:組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)黑牛上皮組織和肉牛肌肉組織，采用第3代的牛SFCs做飼養(yǎng)層。二，牛胚胎干細胞的獲得分離培養(yǎng)及鑒定。牛胚胎干細胞的獲得采用:選取健壯、發(fā)情周期正常、2-3胎母牛做實驗牛，待發(fā)情后用FSH減量注射

3、法激素處理母牛，人工授精，沖胚得到胚胎，將胚胎移至制備好的飼養(yǎng)層培養(yǎng)皿中孵化培養(yǎng)，囊胚ICM細胞數(shù)量增殖4-6d后，得到生長集中、隆起明顯的ICM集落，即牛胚胎干細胞。牛胚胎干細胞分離培養(yǎng)及鑒定:在體視鏡下，用自制的口吸管連接玻璃微針小心挑起ICM，使之與飼養(yǎng)層以及滋養(yǎng)層細胞分離，對牛胚胎干細胞進行傳代培養(yǎng)，并進行形態(tài)學、染色、核型分析等鑒定。
　　 在試驗中選用了三種不同的細胞（牛骨髓間充質(zhì)干細胞、牛成纖維細胞、牛乳腺干細胞）

4、作飼養(yǎng)層來進行分離培養(yǎng)牛ES細胞，比較了其培養(yǎng)效果。選取三種胰酶+EDTA組合（0.25％胰酶-0.04％EDTA、0.20％胰酶-0.04％EDTA和0.02％胰酶-0.04％EDTA）消化處理牛ES細胞，比較其消化效果。對胚胎進行冷凍解凍三種不同處理（鮮胚、凍存解凍1次、凍存解凍2次），觀察牛ESCs生長狀況。
　　 結(jié)果:
　　 1.證明牛ESCs和飼養(yǎng)層有著很大的關系，用牛MSCs做飼養(yǎng)層培養(yǎng)的牛ESCs要比用牛

5、MaSCs和FSCs做飼養(yǎng)層試驗研究效果好;
　　 2.用較低濃度的消化液（0.02％胰酶-0.04％EDTA）消化得到的ESCs克隆率最高，所傳代數(shù)最高，效果較好;
　　 3.冷凍與解凍處理不會對牛ESCs產(chǎn)生損害性的影響，牛ESCs具有一定的抗外界環(huán)境的能力。
　　 4.相近的集落，通過相互吸引，具有自發(fā)形成典型的ES集落的能力。
　　 5.通過形態(tài)學觀察，核型分析，及AKP染色鑒定符合牛ESCs特征