生防萎縮芽孢桿菌CAB-1菌株幾丁質(zhì)酶基因的克隆和原核表達(dá).pdf

1、隨著植物病原菌抗藥性和農(nóng)藥殘留等問(wèn)題的日益突出,利用微生物殺菌劑防治植物病害已成為研究熱點(diǎn)之一。幾丁質(zhì)酶能夠有效降解高等真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)成分,從而抑制或殺死多種植物病原菌,因此,篩選具有幾丁質(zhì)酶活性的拮抗微生物,一方面可以直接利用其抑制植物病原菌的生長(zhǎng),研發(fā)高效微生物殺菌劑;另一方面可以通過(guò)克隆幾丁質(zhì)酶基因,為轉(zhuǎn)基因植物和構(gòu)建生防工程菌株提供抗病基因資源。
　　 1.本研究通過(guò)平板透明圈法從大量生防菌中篩選獲得一株具有幾丁質(zhì)

2、酶活性的細(xì)菌菌株CAB-1,該菌株對(duì)番茄灰霉病菌等多種植物病原真菌表現(xiàn)較強(qiáng)的拮抗活性。通過(guò)生理生化、16S rDNA和gyrB基因序列測(cè)定,將菌株CAB-1鑒定為萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)。
　　 2.通過(guò)對(duì)菌株CAB-1全基因組序列進(jìn)行分析和功能預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)該菌株存在兩個(gè)幾丁質(zhì)酶編碼基因,分別命名為chit1和chit2。通過(guò)PCR技術(shù)從菌株CAB-1中克隆出這兩個(gè)幾丁質(zhì)酶的編碼基因。其中chit1基

3、因全長(zhǎng)為1791 bp,編碼596個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)分子量為65.8 Kda,chit2基因全長(zhǎng)為2091 bp,編碼696個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)分子量為77.8 KDa,兩個(gè)幾丁質(zhì)酶基因序列間隔64 bp。序列對(duì)比發(fā)現(xiàn),菌株CAB-1中的chit1幾丁質(zhì)酶核苷酸序列與萎縮芽孢桿菌模式菌株1942菌株中的幾丁質(zhì)酶基因chi(CP002207.1),以及枯草芽孢桿菌的幾丁質(zhì)酶基因chi(AF069131.1)的同源性都高達(dá)99％;chit2幾丁質(zhì)酶基

4、因與短小芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶操縱元序列(DQ859055.1)同源性為96%。對(duì)氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn),Chit1蛋白N端有36個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列,其后有三個(gè)保守結(jié)構(gòu)域包括幾丁質(zhì)催化域、FⅢ纖連蛋白結(jié)構(gòu)域(Fibronectin typeⅢ like domain)、幾丁質(zhì)結(jié)合域(CBD),屬于18家族幾丁質(zhì)酶中的B亞族。Chit2編碼的氨基酸序列N端也存在一個(gè)信號(hào)肽序列,長(zhǎng)度為32個(gè)氨基酸,且該蛋白也屬18家族幾丁質(zhì)酶,但只有催化域,缺乏F

5、Ⅲ纖連蛋白結(jié)構(gòu)域和幾丁質(zhì)結(jié)合域。
　　 3.將chit1和chit2基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá),SDS-PAGE可檢測(cè)到預(yù)測(cè)大小的目的蛋白,并且利用平板透明圈法顯示chit1和chit2基因的原核表達(dá)產(chǎn)物均表現(xiàn)出幾丁質(zhì)酶活性,利用DNS法測(cè)得chit1原核表達(dá)產(chǎn)物的幾丁質(zhì)酶活性強(qiáng)于chit2。其中chit1的原核表達(dá)產(chǎn)物對(duì)番茄灰霉菌分生孢子的萌發(fā)具有較強(qiáng)的抑制作用,而chit2的原核表達(dá)產(chǎn)物對(duì)番茄灰霉菌沒有明顯的抑制作用。對(duì)