枯草芽孢桿菌菌株CAB-1抑菌物質(zhì)的分離鑒定及活性分析.pdf

1、枯草芽孢桿菌菌株CAB-1是從黃瓜根際土壤中分離篩選到的一株生防細(xì)菌,對(duì)黃瓜白粉病、番茄灰霉病及番茄葉霉病等蔬菜病害均具有良好的防治效果。本研究對(duì)菌株CAB-1產(chǎn)生的三種抑菌物質(zhì):蛋白、脂肽及揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了分離、鑒定和分析。
　　 枯草芽孢桿菌菌株CAB-1的抑菌蛋白:采用40％飽和度硫酸銨對(duì)菌株CAB-1的發(fā)酵上清液進(jìn)行鹽析,得到蛋白粗提物。該蛋白粗提物能明顯降低黃瓜白粉菌分生孢子的萌發(fā)率,并造成菌絲頂端膨大成球狀無(wú)法繼續(xù)生

2、長(zhǎng)。子葉噴霧法測(cè)得其對(duì)黃瓜白粉病的保護(hù)作用和治療作用的防效分別為73.33％和76.85％。單因素實(shí)驗(yàn)表明該蛋白粗提物的最佳產(chǎn)生條件為:3號(hào)培養(yǎng)基,2％接種量,培養(yǎng)溫度30℃,轉(zhuǎn)速180 r／min,裝液量100 mL／250 mL,培養(yǎng)時(shí)間48 h。該粗蛋白對(duì)胰蛋白酶及蛋白酶K不敏感,胃蛋白酶處理使其活性降低14％；抑菌蛋白在100℃以下處理30 min活性變化差異不顯著,而121℃處理30 min其抑菌活性為對(duì)照的72％；抑菌蛋白對(duì)

3、酸堿的耐受范圍廣,在pH值3-12的范圍內(nèi)抑菌活性均能保持在75％以上；經(jīng)甲醇、氯仿、乙酸乙酯及丙酮處理后該粗蛋白的抑菌活性變化不大。采用HiTrap DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱對(duì)蛋白粗提物進(jìn)行分離純化后獲得五個(gè)吸收峰,其中峰Ⅲ具有較大抑菌活性。峰Ⅲ收集液經(jīng)SDS-PGAE檢測(cè)后為單一蛋白條帶,其分子量約為66 KDa,經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定分析該蛋白與putative phage-rela

4、ted pre-neck appendageprotein匹配率最高,分值為135(P<0.05)。
　　 枯草芽孢桿菌菌株CAB-1的脂肽類(lèi)抑菌物質(zhì):采用鹽酸沉淀法提取得到脂肽類(lèi)物質(zhì),子葉噴霧法測(cè)得該物質(zhì)對(duì)黃瓜白粉病的防效為76.17％。MALDI-TOF-MS分析結(jié)果顯示該脂肽類(lèi)物質(zhì)的[M+H]+值分別呈現(xiàn)1447.725,1461.813,1477.109和1500.041,1513.839,1527.566兩類(lèi)信號(hào)。其中

5、1447.725,1461.813,1477.109推測(cè)為Fengycin A(C15.C17)；而在目前的報(bào)道中并沒(méi)有檢索到與1500.041,1513.839和1527.566分子量相似的脂肽類(lèi)物質(zhì),推測(cè)可能是一種新的物質(zhì)。
　　 枯草芽孢桿菌菌株CAB-1的揮發(fā)性抑菌物質(zhì):通過(guò)平板熏蒸法測(cè)定了菌株CAB-1所產(chǎn)揮發(fā)性抑菌物質(zhì)(VCs)對(duì)黃瓜白粉菌的抑制作用,結(jié)果表明VCs對(duì)黃瓜白粉病的防效為85.44％。經(jīng)GC-MS分析鑒