脫氫表雄酮對肉雞肝臟脂肪代謝的影響及其細胞分子生物學機理研究.pdf

1、脫氫表雄酮（Dehydroepiandrosterone，DHEA）是類固醇激素合成過程的中間產(chǎn)物，在循環(huán)血液中主要以硫酸酯形式（Dehydroepiandrosterone sulfate，DHEA-S）存在.DHEA經(jīng)靶器官中相關酶系的作用，可轉化為多種類固醇激素。近年來因其廣泛參與機體內(nèi)一系列重要的生理反應而日益受到重視.DHEA對脂代謝方面的影響已較為肯定，但對肉雞脂代謝方面的研究很少，其具體作用機理還不是十分清楚.本文選用生長

2、速度快、腹部脂肪沉積多的Arbor Acres肉雞（簡稱AA肉雞）為實驗動物，研究外源性DHEA對肉雞肝臟脂肪代謝的影響；通過建立雞胚原代肝細胞培養(yǎng)體系，探討DHEA對雞胚原代肝細胞脂代謝關鍵因子基因表達、cAMP/PKA信號通路及相關轉錄因子的影響，為深入探討DHEA調控肉雞脂肪沉積作用提供實驗和理論依據(jù).
　　 1 DHEA對AA肉雞生產(chǎn)性能及相關代謝激素水平的影響
　　 180羽1日齡AA肉雞（38g左右）隨機分為

3、對照組，飼料中添加20mg/kg和5mg/kgDHEA的高、低劑量組，每組3個重復，每個重復20只.飼喂至42日齡分別從各組隨機選取12只公雞和12只母雞，采集血樣、肝臟、腹脂.試劑盒測定肝臟中甘油三酯(TG)、非酯化脂肪酸(NEFA)含量以及肝脂酶(HL)活性；RIA法測定血清三碘甲腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)、游離三碘甲腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)、胰高血糖素(Glucagon)、瘦素(Leptin)含量.結果顯

4、示，與對照組相比，DHEA顯著降低公、母肉雞體重和腹脂率，提高相對肝重；顯著降低肝臟中TG含量，提高HL活性和NEFA水平；DHEA可顯著降低公雞血清中T4、FT3、FT4的含量，顯著升高Glucagon和Leptin水平；同樣，DHEA可顯著降低母雞血清中FT3和FT4含量，顯著升高Leptin水平.結果提示，DHEA可能通過影響肉雞體內(nèi)脂類分解相關酶的活性及激素水平，對脂類代謝起調節(jié)作用，且這種作用存在性別差異。
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5、DHEA對AA肉雞肝臟脂肪代謝關鍵因子基因表達和肝組織超微結構的影響與調節(jié)研究
　　 180羽1日齡AA肉雞(38g)隨機分為對照組，飼料中添加20mg/kg和5mg/kgDHEA的高、低劑量組，每組3個重復，每個重復20只.飼喂至42日齡時分別從各組隨機選取12只公雞和12只母雞，采集肝臟.RT-PCR半定量檢測肉雞肝臟脂肪代謝關鍵因子固醇調節(jié)元件結合蛋白-1（SREBP-1）、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、過氧化物酶體增殖物激

6、活受體α(PPARα)、肉堿棕櫚酰轉移酶Ⅰ(CPTⅠ)和脂酰輔酶A氧化酶1(ACOX1)基因mRNA水平；透射電鏡觀察肝組織超微結構.結果顯示，與對照組相比，DHEA對公、母雞肝臟SREBP-1和ACC表達水無明顯影響；DHEA顯著上調PPARα、CPTⅠ和ACOX1 mRNA水平；DHEA處理后可顯著增加公、母雞肝細胞中過氧化物酶體數(shù)目.結果提示，DHEA降脂的主要機理是通過提高脂肪分解代謝關鍵因子表達以及過氧化物酶體數(shù)量，加快脂肪酸

7、β-氧化進程，以減少脂肪在肝臟的合成。
　　 3 DHEA對雞胚原代肝細胞脂肪代謝關鍵因子基因表達和細胞超微結構的影響與調節(jié)研究
　　 選用體外條件下培養(yǎng)的雞胚原代肝細胞為實驗對象，用含DHEA終濃度為0μmol/L、1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L的培養(yǎng)液孵育細胞。分別作用1h、2h、4h、6h、12h、24h、48h、72h及6d后吸出培養(yǎng)液，收集細胞，待測.RT-PCR半定量檢測肝細胞脂肪代謝關

8、鍵因子SREBP-1、ACC、PPARα和CPTⅠmRNA水平：透射電鏡觀察DHEA處理6d的肝細胞超微結構；MTT法測定DHEA處理肝細胞24h、48h、72h后的細胞存活率.結果顯示，10μmol/L和100μmol/LDHEA處理肝細胞1h和2h能極顯著降低SREBP-1和ACC的mRNA水平，隨后開始上升，在4-48h內(nèi)與對照組相比沒有顯著性差異.10μmol/LDHEA在作用肝細胞1h和2h能極顯著降低PPARα的mRNA水平

9、，100μmol/LDHEA處理組則在2h顯著降低，隨后開始升高，在6-48h以上兩個處理組顯著提高PPARα的mRNA水平。10μmol/L和100μmol/LDHEA處理肝細胞1-4h對CPTⅠ的mRNA水平無顯著性影響，隨著作用時間的延長，6-48h內(nèi)CPTI的mRNA水平極顯著升高.1μmol/LDHEA處理組在各個時間點對上述基因mRNA水平均無顯著性影響；透射電鏡結果顯示，與對照組相比，10μmol/L和100μmol/LD

10、HEA使肝細胞中線粒體數(shù)目和基質電子密度明顯提高；細胞存活率試驗表明，1μmol/LDHEA處理肝細胞72h顯著提高細胞存活率，與之相反，100μmol/LDHEA在各個時間點均顯著降低細胞存活率，10μmol/LDHEA處理組與對照組相比無顯著性差異.結果提示，10μmol/LDHEA在不影響肝細胞存活率的前提下，通過調控脂肪合成、分解代謝關鍵因子基因表達以及改變細胞超微結構，增強脂肪酸β-氧化，加快脂肪酸動員，降低肝細胞脂肪的合成。

11、
　　 4 DHEA對雞胚原代肝細胞cAMP/PKA信號通路和相關轉錄因子的影響與調節(jié)研究
　　 選用體外條件下培養(yǎng)的雞胚原代肝細胞為實驗對象，用含DHEA終濃度為0mol/L、0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L的培養(yǎng)液孵育細胞，在作用20min后吸出培養(yǎng)液，收集細胞.RIA法檢測胞內(nèi)3’，5，-環(huán)腺苷酸（cAMP）含量.結果顯示，與對照組相比，0.1-100μ

12、mol/LDHEA組cAMP含量均顯著提高，其中0.1μmol/LDHEA組cAMP含量最高.因此，以0.1μmol/LDHEA為試驗組，分別在作用5min、10min、20min、30min和60min后收集細胞，分別檢測胞內(nèi)cAMP含量以及腺苷酸環(huán)化酶(AC)、磷酸二酯酶(PDE)和蛋白激酶A(PKA)活性；Westernblot法測定轉錄因子SREBP-1蛋白水平和cAMP反應元件結合蛋白(CREB)磷酸化水平.結果顯示，O.1μ

13、mol/LDHEA作用肝細胞5-30min能顯著提高胞內(nèi)cAMP含量，且在20min達到最高，隨著作用時間的延長，到60min時與對照組相比并無顯著性差異。此外，試驗組PDE活性在10min和20min均顯著降低，而PKA活性在10min和20min顯著提高，AC活性在各個時間點均無顯著性差異；對相關轉錄因子的研究發(fā)現(xiàn)，DHEA處理可顯著降低雞胚原代肝細胞內(nèi)SREBP-1蛋白水平，而CREB磷酸化水平則顯著提高，且以上效應均被PKA的抑