馬鈴薯紡錘塊莖類病毒遺傳多樣性及其誘導的基因沉默.pdf

1、類病毒是能夠侵染多種植物并造成重大經濟損失的RNA分子。類病毒由于特有的基因序列和結構特點，提供寄主.病原相互作用的一個最佳的研究模式。RNA沉默是植物和其它真核生物用來防御外來核酸侵染的一種保守的防御機制。在病毒誘導的基因沉默途徑（Virusinducing gene silencing，VIGS）中，21～24 nt病毒小分子RNAs（vsiRNA）的產生是植物抗病毒RNA沉默誘發(fā)的標志。目前對于vsiRNA生物合成的機制及其生物學

2、功能的還沒有完全研究清楚。與之相對應，很多病毒通過編碼RNA沉默抑制子蛋白或直接以病毒RNA來拮抗植物的抗病毒RNA沉默。植物在受到類病毒侵染后同樣會啟動VIGS途徑產生類病毒?；缘男NA，然而，裸露的類病毒非編碼RNAs如何能逃脫細胞內的抗病毒RNA沉默呢?
　　 本研究針對在我國馬鈴薯主產區(qū)黑龍江省采集的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（Potato spindletuber viroid，PSTVd）樣品，進行基因克隆和序列分析，

3、開展PSTVd遺傳變異多樣性的研究。同時，以PSTVd為研究對象，利用分子生物學技術，深入研究PSTVd侵染植物后誘導的基因沉默，了解類病毒是否也會象病毒那樣，對寄主的防御系統(tǒng)產生沉默抑制功能，從而實現其侵染目的。同時，還研究在沉默過程中所產生的siPSTVd的生物合成機制及其是否對植物體內的miRNA合成途徑有所影響。研究結果如下：
　　 1、類病毒具有遺傳變異多樣性，其在寄主體內以相近變異群體進行傳播。
　　 對克山

4、馬鈴薯所提供的PSTVd陽性試管苗樣品PKS1-6進行序列測定，結果顯示其序列與已報道的強株系（KF440-2、RG1）與中間株系（PSTVd int）有較大的序列差異，同源性僅為97.21％、97.77％和98.61％，而與所報道的弱株系KF-5、GI333357和GBX76844同源性較大，分別為99.16％、99.72％和99.44％。因此，從序列上看PKS1-6更接近于弱株系。用PKS1-6分離物接種轉GFP基因煙草16C，對侵

5、染后陽性樣品的PSTVd進行序列測定，結果發(fā)現在4個測定序列中，有3個類病毒序列與接種的PSTVd序列相比發(fā)生了變異，變異部位在中央保守區(qū)有3處（81、82和267位），在可變區(qū)有2處（127和136位），致病區(qū)有1處（56位）。說明，類病毒序列有一定保守性和可變性，其變異可能受環(huán)境條件、寄主范圍等因素影響，其變化也不僅僅局限在可變區(qū)（V區(qū)）。對于采自富錦的田間PSTVd一份陽性樣品進行序列分析，在6個克隆中，有5個與PKS1-6序列同

6、源，只有一個PFJ-14有2個突變，發(fā)生在左末端區(qū)（40位）和致病區(qū)（296位）。對于采自泰康的一份陽性田間樣品，對其11個克隆進行序列測定，有4個與PKS1-6同源，有7個發(fā)生了變異。
　　 研究中共對來自克山馬鈴薯所和采自富錦、泰康馬鈴薯田的PSTVd陽性樣品的22個PSTVd克隆進行序列測定，共產生12個不同序列，其中與PKS1-6分離物序列相同的變異物有10個，其核苷酸差異數量在0～3個之間，同源性在99.16％～100

7、％。二級結構的最低自由能變化為-159.10～-173.60 kcal/mol。其序列變異主要分布在CCR區(qū)和可變區(qū)，變異頻率分別為38.1％和28.9％。其次為致病區(qū)（變異頻率為14.3％）和左、右末端區(qū)（變異頻率均為9.5％）。
　　 2、類病毒能誘導寄主產生沉默，但不具有沉默抑制子功能。
　　 利用我們構建的含有類病毒正負鏈單體和雙體的植物表達載體分別與含報道基因GFP載體的農桿菌共注射轉GFP基因煙草16C，發(fā)現

8、與類病毒共注射的葉片的熒光弱于對照，表明類病毒可能在一定程度上促進了GFP的沉默。對PSTVd和GFP的序列進行比對，其同源性僅為47.6％（Identity），最長的同源區(qū)域（Longest identitied seq）僅為9 bp，不具有產生沉默的條件。為了排除類病毒載體對共注射的GFP載體中的35S啟動子產生沉默，又利用含有pdsi的發(fā)夾載體與類病毒載體共注射煙草葉片，觀察葉片白化現象。結果，類病毒還是促進了煙草PDS基因的沉默

9、。但Northern blot雜交結果表明35S啟動子來源的siRNA積累水平與空載體對照沒有明顯差異，表明類病毒促進的沉默不是在啟動子上。同時，對GFP和PSTVd共注射的樣品進行mGFP的Nothern blot雜交，結果顯示，GFP和PSTVd共注射的mGFP的量少于GFP與空載體共注射的量。說明，在mGFP的轉錄水平上，受共注射的PSTVd的影響，GFP mRNA的積累量減少，從而熒光減弱。通過這些結果我們推斷，類病毒促進的基因

10、沉默可能與甲基化有關，可能發(fā)生在轉錄水平上。
　　 3、類病毒產生的siPSTVd來源于成熟的二級結構。
　　 通過對含有PSTVd可復制的雙體負鏈載體和非全長不可復制的載體注射煙草后的siPSTVd的檢測結果顯示，均檢測到了特異性的siPSTVd，說明除了復制形成的dsRNA這一來源外，PSTVd形成的二級結構也是產生siPSTVd的重要來源。從誘發(fā)產生siRNA的數量比例上看，其中數量比例較多的是（+）siRNAs。

11、這個觀察結果與PSTVd RNA基因組折疊成高度結構化二級結構，然后在體內被.DCL切割的理論相一致。
　　 4、類病毒侵染產生的siPSTVd沒有調控內源的miRNA途徑。
　　 對于接種番茄（Rutgers）和馬鈴薯的陽性樣品和對照陰性樣品雜交結果顯示：陽性樣品均檢測到siPSTVd（±），證明類病毒侵染番茄和馬鈴薯后，誘導寄主產生基因沉默現象。而沒有接種類病毒的番茄和馬鈴薯，沒有檢測到siPSTVd（±）。對同一張

12、膜，同時檢測了mi159和mi167，結果顯示，受類病毒侵染的馬鈴薯和番茄植株與健康植株相比，miRNA積累水平無明顯變化，煙草植株之間的miRNA的積累水平也沒有明顯變化，表明類病毒的入侵對植物體內的miRNA途徑影響不大，至少對兩個主要miRNA（mi159和mi167）產生途徑沒有影響。
　　 研究類病毒侵染植物的策略有助于揭示基礎的分子生物和細胞加工的機理，對于植物和其它有機物細胞和分子生物學的整體產生重要影響。通過對這