美花蘭冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子基因CiDREB1的克隆及特性分析.pdf

1、植物能感知、傳遞逆境脅迫信號，誘導(dǎo)相關(guān)功能的基因表達(dá)，在生理生化上作出適應(yīng)性響應(yīng)。轉(zhuǎn)錄因子在信號的傳遞、相關(guān)功能基因的表達(dá)調(diào)控以及發(fā)育階段的調(diào)控中起著重要的作用。近年來，AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子受到廣泛關(guān)注，研究表明，DREB(Dehydration Responsive Element Binding protein)類轉(zhuǎn)錄因子可以用于改良植物對生物脅迫和非生物脅迫的耐性。美花蘭是一種重要的觀賞植物，研究其抗凍分子機(jī)制有著重要的意義

2、。本實驗旨在從美花蘭中克隆得到一個低溫誘導(dǎo)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因，并對其進(jìn)行功能分析。 本實驗利用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技術(shù)從美花蘭中克隆了一個低溫誘導(dǎo)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為CiDREB1(GenBank注冊號為EF654657)。CiDREB1的cDNA序列全長1265bp，含有一個927bp的完整開放閱讀框，編碼309個氨基酸。對推測的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果

3、顯示，其編碼的蛋白包含一個64個氨基酸的典型的AP2 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。AP2結(jié)構(gòu)域空間預(yù)測顯示該結(jié)構(gòu)域具有AP2/EREBP典型的一個α-螺旋三個β-折疊結(jié)構(gòu)。該基因不含有內(nèi)含子。 RT—PCR分析了CiDREB1基因的表達(dá)特性，將美花蘭組培苗置于4℃處理不同時間，分別提取總RNA。結(jié)果顯示CiDREB1基因在未處理的材料中表達(dá)量水平很低，表達(dá)量在0.5h內(nèi)開始積累，在6h時達(dá)到最大，24h時基本下降到未處理前的水平。

4、 采用的是將目的基因與綠色熒光蛋白融合表達(dá)的方法研究CiDREB1轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位情況，結(jié)果表明CiDREB1轉(zhuǎn)錄因子定位在細(xì)胞核中。 轉(zhuǎn)錄激活功能分析顯示，轉(zhuǎn)化了YepGAP—CiDREB1重組載體的野生型酵母菌株能夠在含有10mmol/L3-AT的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基(SD/His—/Ura—/Trp—)上生長，而且可以使含X—gal的Z buffer變藍(lán)，但是轉(zhuǎn)化了相同重組載體的突變型酵母菌株既不能夠在含有10mmol/L

5、3-AT的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基(SD/His—/ura—/Trp—)上生長，也不能使含X—gal的Z buffer變藍(lán)，這說明CiDREB1可以特異識別結(jié)合：DRE順式作用元件，激活下游基因。 通過農(nóng)桿菌侵染，將CiDREB1分別轉(zhuǎn)化到了擬南芥和煙草中，并對后代進(jìn)行了檢測。經(jīng)過抗生素篩選和分子檢測證明CiDREB1基因已經(jīng)整合到煙草和擬南芥基因組中。獲得擬南芥抗性植株25株，轉(zhuǎn)化效率約1．0％。獲得轉(zhuǎn)CiDREB1基因的煙草抗性苗6