豬鏈球菌流行病學調(diào)查和PCR-RFLP基因分型研究.pdf

1、豬鏈球菌是一種條件性致病菌，通常定居在感染豬的上顎扁桃體，當感染豬的抵抗力降低時，可能引發(fā)豬鏈球菌病的流行，因此從豬扁桃體內(nèi)分離豬鏈球菌對該病的流行病學監(jiān)測具有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)相同血清型的不同菌株及不同血清型菌株間的毒力存在差異，而且相同血清型的菌株并不完全導(dǎo)致相同的疾病，但傳統(tǒng)的血清分型方法不能很好反映菌株的特征。本試驗嘗試建立一新的基因分型方法PCR-RFLP對豬鏈球菌進行研究。
　　 1.表現(xiàn)健康豬的豬鏈球菌流行病學調(diào)

2、查：對采自杭州、重慶等20個不同地區(qū)屠宰場的248份扁桃體或淋巴結(jié)樣品進行細菌分離培養(yǎng)，然后用GDH、CPS1i、CPS2j、CPS7h、CPS9g基因序列的PCR方法進行種型鑒定并用血清凝集試驗復(fù)檢，隨后檢測其毒力因子檢測，應(yīng)用多位點序列分型（Multilocussequencetyping，MLST）系統(tǒng)研究菌株間的遺傳關(guān)系。結(jié)果：從248份樣品中共檢出14株豬鏈球菌（檢出率為5.65％），其中3株為豬鏈球菌2型，2株為豬鏈球菌7型

3、，1株為豬鏈球菌9型，8株不能定血清型；6株定型菌株血清凝集試驗結(jié)果與PCR鑒定結(jié)果一致；對6株定型菌進行6個毒力因子（mrp、epf、sly、orf2、fops、gapdh）檢測發(fā)現(xiàn)5種毒力基因型：A1Cps2+mrp-epf+sly+orf2+tbps+gapdh+、A2Cps2+mrp-epf+sly-orf2_fbps+gapdh-、A3Cps7+mrp+epf-sly-orf2-tbps-gapdh+、A4Cps9+mrp-e

4、pf-sly-orf2-fbps+gapdh+、A5Cps7+mrp-epf-sly-orf2+tbps+gapdh+，A1和A2型的菌株為弱毒株；經(jīng)MLST分析3株豬鏈球菌2型屬于ST1，1株7型屬于ST29，1株9型（CQ15）屬于一個新ST型，該型被豬鏈球菌MLST數(shù)據(jù)庫（http：//ssuis.mlst.net）收錄并編號為ST128。
　　 2.PCR-RFLP的建立及其在豬鏈球菌基因分型中的應(yīng)用：本試驗對32個血清

5、型（1～31，1/2）豬鏈球菌參考株和47株背景明確的豬鏈球菌分離株的16S-23SISR序列進行擴增，首先建立并優(yōu)化PCR最佳反應(yīng)體系、反應(yīng)條件和酶切最佳反應(yīng)體系、反應(yīng)條件，擴增產(chǎn)物經(jīng)酶切、凝膠電泳，最后在紫外燈下觀察電泳圖譜。結(jié)果：1上述菌株的PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后共得到22種RFLP型：其中Aa型有25株，占總菌株數(shù)的31.6％；Ⅰb型有20株，占總菌株數(shù)的25.3％；Bf型有7株，占總菌株數(shù)8.9％；Ga型有4株，占總菌株數(shù)的5.

6、1％；Be和Ka型各有3株，占總菌株數(shù)3.8％；Bh型有2株，占總菌株數(shù)2.5％；Eb、Bb、Gg、Di、Hc、Fj、Ca、Bd、Jk、Ll、Ie、Bm、Ag、Mn、Io型各有一株.2對酶切基因型進行統(tǒng)計分析，獲得的PCR-RFLP方法的分辨指數(shù)為0.83。3豬鏈球菌1/2型和2型經(jīng)PCR-RFLP分析，產(chǎn)生不同的RFLP型，可以區(qū)分這兩種血清型，而其他的血清型無法用該法區(qū)分。4分離株中共有18株強毒株，其中7型一株，9型一株，2型16