重慶市豬鏈球菌流行病學(xué)調(diào)查及GDH基因的克隆和序列分析.pdf

1、1豬鏈球菌1、2、7和9型的二重PCR方法的建立以豬鏈球菌特異性的谷氨酸脫氫酶基因(gdh)及豬鏈球菌型特異性的莢膜多糖合成相關(guān)的基因(cps1J，cps2J，cps7H，cps9G)為目的基因，設(shè)計合成五對引物，分別擴(kuò)增1型的gdh和cps1J，2型的gdh和cps2J，7型的gdh和cps7H，9型的gdh和cps9G，建立了豬鏈球菌1、2、7和9型的二重PCR方法，并用豬鏈球菌所有35個血清型的參考菌及1株B群鏈球菌和1株C群鏈球

2、菌驗證了1、2、7和9型二重PCR方法的特異性。對1、2、7和9型二重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆并序列分析表明，其擴(kuò)增產(chǎn)物為特異性的目的基因片段；用菌落計數(shù)法對二重PCR進(jìn)行了敏感性試驗，結(jié)果1、2、7和9型的二重PCR都在100咖時仍能擴(kuò)增出目的基因片段；12株已知的2型菌用2型的二重PCR方法進(jìn)行了檢測，其檢測符合率為100％；10株疑似的豬鏈球菌用1、2、7和9型的二重PCR進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中的2株菌為7型豬鏈球菌，2株菌為9型

3、豬鏈球菌；同時，在長達(dá)一年的時間內(nèi)定期進(jìn)行了1、2、7和9型二重PCR試驗，結(jié)果表明，1、2、7和9型的二重PCR具有很好的穩(wěn)定性。 2用1、2、7和9型的二重PCR方法對重慶地區(qū)豬鏈球菌進(jìn)行檢測和鑒定在重慶市的20個區(qū)縣隨機(jī)采取了1360份健康豬的扁桃體和116份病豬組織，結(jié)合血清學(xué)方法等方法，用所建立的豬鏈球菌1、2、7和9型的二重PCR方法對其進(jìn)行了豬鏈球菌的檢測。從1360份健康豬扁桃體中檢測鑒定出豬鏈球菌224株，其檢

4、出率達(dá)到16.5％。224株豬鏈球菌中，2型菌有5株，分別來自3個區(qū)縣；7型菌有4株，分別來自4個區(qū)縣；9型菌有4株，分別來自2個區(qū)縣；未能檢測到1型豬鏈球菌；210株菌未能進(jìn)行定型。而從116份病豬組織中檢測鑒定出了8株豬鏈球菌，分別來自4個區(qū)縣，但不是1、2、7和9型豬鏈球菌。 本次試驗中，檢測到1株1/2型豬鏈球菌，為我國首次報道。 3豬鏈球菌2、7和9型重慶分離株毒力因子mrp和epf的檢測和其中的一些新發(fā)現(xiàn)溶菌

5、酶釋放蛋白(MRP，mrp)、胞外因子(EF，epf)被認(rèn)為是豬鏈球菌中兩個至關(guān)重要的毒力因子，這兩種毒力因子有時也表現(xiàn)為：MRP<'*>(大分子量MRP，mrp<'*>)、MRP<'s>(小分子量MRP，mrp<'s>)、EF<'*>(大分子量的EF，epf<'*>)，而不同分子量的MRP和EF也與菌株的毒力或致病性的不同有較強(qiáng)的相關(guān)性。對包括重慶分離株在內(nèi)的共26株豬鏈球菌2型菌(25株從豬上分離，1株從人上分離)進(jìn)行了毒力因子mr

6、p和epf的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分分離自發(fā)病豬(包括病人)上的2型菌株均為mrp<'+> epf<'+>，只有菌株SH0401為mrp<'+>epf<'+>，而大部分從健康豬扁桃體分離的2型菌為mrp<'->epf<'+>(即表現(xiàn)為缺失毒力因子mrp)，只有菌株CWTN63為mrp<'+>epf<'+>，另外，2型參考菌株735為mrp<'->epf<'+>。對其中10株菌的epf進(jìn)行了克隆并序列分析，發(fā)現(xiàn)它們的核苷酸同源性都在99％以上

7、。對菌株SH0401和735的epf<'*>進(jìn)行了克隆，其序列與GenBank公布的菌株1890的序列相一致。對包括重慶分離株在內(nèi)的共15株2型以外(包括1、1/2、7、9型)的菌株進(jìn)行了毒力因子mrp的檢測，結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)三株7型菌(CQBB214、CQWZ10、8074)和一株1/2型菌(CQFL42)均能擴(kuò)增出474bp的基因片段，這一結(jié)果在國內(nèi)外均未見相關(guān)報道。對擴(kuò)增出的474bp基因片段克隆并序列分析發(fā)現(xiàn)，其序列中的465bp與

8、2型菌的mrp(1148bp)幾乎是一致(同源性達(dá)到了99％以上)，但2型菌卻比其多出了670bp的一段序列。另外，還發(fā)現(xiàn)一株7型菌BJ09為mrp<'*>(2000bp左右)，對其序列分析表明，其序列中的800bp與2型菌的mrp幾乎一致(同源性達(dá)到了98％以上)，但其800bp以后的序列則與2型菌的mrp序列完全不同。同時還對這15株菌進(jìn)行了毒力因子epf的檢測，結(jié)果沒有檢出epf。 4 豬鏈球菌谷氨酸脫氫酶(GDH)基因的

9、克隆和序列分析有研究表明，豬鏈球菌谷氨酸脫氫酶(GDH)既是一種保護(hù)性抗原，又能作為一種診斷性抗原，且與其它蛋白相比，GDH有很低的點突變率和高度保守等優(yōu)點。因此，GDH有著越來越廣闊的應(yīng)用前景。 本試驗對44株各型(包括1、2、1/2、7、9、4、19、27、30、31型和1株未知型)豬鏈球菌的谷氨酸脫氫酶基因(gdh)開放閱讀框(1347bp)進(jìn)行了克隆并序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有的2型菌的gdh的同源性都在99％以上，而各型

10、之間的同源性大多也能達(dá)到94％以上。同時還發(fā)現(xiàn)2型以外其他型豬鏈球菌的gdh在162、279、534、898、916、978、981、991、1011、1023、1068、1077、1083、1098、1104、1107、1137、1158和1224位處的核苷酸發(fā)生了突變，表明這些位點上核苷酸的突變與豬鏈球菌血清型的改突變有明顯的相關(guān)性，也說明這些位點是重要的突變位點。同時發(fā)現(xiàn)gdh的978～1023位點和1060～1120位點是其兩個