絞股藍皂甙調控山羊瘤胃甲烷生成的時間效應及作用機制的研究.pdf

1、全球暖化是嚴重的環(huán)境問題之一，其主要原因是大氣中二氧化碳(CO2)、甲烷(CH4)和一氧化二氮(N2O)等溫室氣體濃度的不斷增加。甲烷是一種強烈的溫室氣體，雖然甲烷在空氣中的含量低于二氧化碳，但是甲烷造成全球暖化的影響作用是二氧化碳的20～30倍。飼料在反芻動物瘤胃內(nèi)被各種微生物發(fā)酵產(chǎn)生的甲烷不能被動物利用，而是以噯氣的方式排出體外，這不僅會加劇溫室效應，而且還會造成2-15％飼料總能量的損失。因此，采取措施減少動物源甲烷的排放將有助于

2、緩解全球氣候變暖，同時還可以降低瘤胃發(fā)酵的能量損失，提高飼料利用率。近幾十年來，由于抗生素等飼料添加劑的廣泛使用嚴重危害畜禽和人類健康，植物提取物作為一種抗生素替代品在畜禽養(yǎng)殖上越來越受到重視。很多研究者發(fā)現(xiàn)，皂甙類物質具有調節(jié)瘤胃微生物發(fā)酵、抑制原蟲數(shù)量、降低甲烷產(chǎn)量等作用。但是，這些研究都基于短期的在體試驗或體外發(fā)酵試驗的結果，皂甙對甲烷生成的抑制作用是否能長期存在，是否具有作為綠色添加劑長期開發(fā)利用的價值尚未清楚。此外，研究還發(fā)現(xiàn)

3、皂甙對甲烷生成的抑制作用與日糧精粗比有關，盡管這方面的報道結果并不一致。為此，本論文首先通過體外試驗研究不同精粗比條件下絞股藍皂甙對甲烷生成的抑制作用。其次，在該研究的基礎上，通過長期瘤胃灌注絞股藍皂甙，研究其對瘤胃甲烷生成、發(fā)酵特性及菌群作用的時間效應。最后，通過體外多次傳代試驗，對絞股藍皂甙抑制甲烷生成的作用機制和瘤胃菌群對絞股藍皂甙的耐受性進行進一步探討。
　　1不同精粗比條件下添加絞股藍皂甙對瘤胃體外甲烷生成、發(fā)酵特性及微

4、生物區(qū)系和數(shù)量的影響
　　本試驗以羊草、玉米和豆粕的混合物為底物，采用體外產(chǎn)氣量法研究不同精粗比條件下，絞股藍皂甙對甲烷產(chǎn)量、發(fā)酵特性及微生物區(qū)系和數(shù)量的影響。試驗采用2×2雙因子試驗設計，即2個底物精粗比(玉米和豆粕∶羊草=70∶30和30∶70）和2個絞股藍皂甙添加量（0mg和16mg）。瘤胃液取自3只安裝有永久性瘤胃瘺管的南京本地山羊。發(fā)酵2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h時，測定產(chǎn)氣量和甲烷的產(chǎn)量，并在發(fā)酵4

5、8h后采集發(fā)酵液樣品測定瘤胃發(fā)酵參數(shù)和微生物。結果顯示，發(fā)酵過程中高粗料組的產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量均極顯著低于高精料組(P＜0.01)。高粗料底物條件下添加絞股藍皂甙顯著降低了48h的累計產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量，使甲烷產(chǎn)量降低了14.49％。但高精料底物條件下皂甙處理組和對照組之間甲烷產(chǎn)量和產(chǎn)氣量均沒有差異。不同精粗比條件下，添加絞股藍皂甙均提高了發(fā)酵液的pH值，尤其是高粗料底物條件下差異顯著（P＜0.05），但對氨態(tài)氮和微生物蛋白濃度沒有顯著影響

6、。高精料底物條件下，發(fā)酵液中的各種揮發(fā)性脂肪酸的濃度在皂甙處理組和對照之間的差異不顯著。然而，在高粗料底物條件下，添加絞股藍皂甙顯著降低了發(fā)酵液乙酸濃度和略提高了丙酸濃度從而使乙酸/丙酸比例顯著降低（P＜0.05）。兩種不同精粗比條件下添加皂甙均顯著提高了發(fā)酵液丁酸的濃度。DGGE結果顯示，與高粗料組相比，高精料底物條件下，細菌和原蟲DGGE圖譜上的有些條帶消失，而甲烷菌DGGE圖譜上多了一些條帶。但是，在不同精粗比條件下，添加絞股藍皂

7、甙對于瘤胃總細菌、原蟲和產(chǎn)甲烷菌的區(qū)系結構沒有明顯的影響，無差異性條帶出現(xiàn)。定量PCR結果顯示，發(fā)酵體系中精粗比的改變顯著影響了黃化瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、真菌和原蟲的數(shù)量（P＜0.05），但對甲烷菌和總細菌數(shù)量沒有明顯的作用。高粗料底物條件下，皂甙處理組琥珀酸絲狀桿菌和原蟲數(shù)量顯著降低(P＜0.05)，而甲烷菌的mcrA基因數(shù)量（P＜0.10）及總細菌、真菌和黃花瘤胃球菌數(shù)量均具有下降的趨勢。與對照組相比，高精料底物條件下，添加絞

8、股藍皂甙對這些微生物的數(shù)量均沒有影響。以上的結果說明，絞股藍皂甙在高粗料底物條件下，通過抑制瘤胃中原蟲、甲烷菌及纖維降解茵等各種微生物的數(shù)量來降低甲烷的產(chǎn)量。但是，在高粗料底物條件下添加絞股藍皂甙對甲烷產(chǎn)量及相關的微生物數(shù)量和區(qū)系沒有任何影響。
　　2瘤胃灌注絞股藍皂甙對山羊甲烷生成、瘤胃發(fā)酵特性及微生物生態(tài)變化的時間效應和血液指標的影響
　　本試驗通過山羊瘤胃內(nèi)長期灌注絞股藍皂甙研究絞股藍皂甙對瘤胃甲烷生成、發(fā)酵特性及微生

9、物生態(tài)的長期效應。8頭安裝有瘤胃瘺管的1歲左右本地山羊采用2×2交叉設計分成兩組。絞股藍皂甙每天的灌胃量為:對照組0g/天/頭，處理組6g/天/頭。試驗共兩期，每期分5個階段，包括一個21天的基礎日糧適應階段（第二期為交換階段）和四個21天的試驗階段。以絞股藍皂甙灌注量與不同階段作為主要因子，研究瘤胃灌注絞股藍皂甙對瘤胃甲烷生成、發(fā)酵特性及微生物的影響。將絞股藍皂甙在60mL生理鹽水中混勻，分兩次在8:00和17:00點從瘺管處灌注到瘤

10、胃里，對照組灌注相同體積的生理鹽水。日糧以山羊維持需要量配制，精粗比為3:7。從每階段的第十四天開始，用INNOVA1412紅外光聲譜氣體監(jiān)測儀和INNOVA1309多點采樣儀測定甲烷產(chǎn)量。每三天記錄一次剩余料量來計算采食量，每階段的最后兩天分別在晨飼前的0h和飼喂后2h、4h、8h，利用負壓原理抽取瘤胃內(nèi)容物測定各種指標。每一期結束后，于次日采食前0h在山羊右頸靜脈采血測定血清指標。結果顯示，添加絞股藍皂甙對不同階段山羊干物質采食量沒

11、有顯著的影響。與對照組相比，甲烷排放量在階段1和2分別降低了6.08％和6.76％(P＜0.05)，但是在最后兩個階段逐漸上升。整個試驗期，絞股藍皂甙對瘤胃pH值、微生物蛋白沒有明顯的影響。但處理組的氨態(tài)氮濃度從第一階段開始逐漸降低的趨勢（P＜0.10）。此外，丁酸、戊酸和異戊酸濃度也沒有發(fā)生顯著變化。但是，處理組各階段丙酸濃度略高于對照組。處理組的乙酸濃度在試驗的第一階段和第二階段顯著低于對照組（P＜0.05），而且在這兩個階段，乙酸

12、/丙酸比例和總揮發(fā)性脂肪酸濃度也顯著降低（P＜0.05），然而在第三和第四階段又恢復到基礎階段的水平。皂甙處理后異丁酸濃度降低，尤其第一階段差異顯著（P＜0.05）。瘤胃灌注絞股藍皂甙對于瘤胃總細菌、產(chǎn)甲烷菌和原蟲的區(qū)系結構沒有明顯的影響，DGGE圖譜上沒有差異性條帶出現(xiàn)。定量PCR結果中甲烷菌的mcrA基因數(shù)量和原蟲數(shù)量具有與甲烷產(chǎn)量相同的變化趨勢。與對照組相比，處理組甲烷菌的mcrA基因數(shù)量在第一階段和第二階段分別低于22.4％和2

13、8.04％(P＜0.10)，而處理組的原蟲數(shù)量在第一、第二階段分別降低14.7％和12.3％(P＜0.10)，但在試驗的第三和第四階段逐漸恢復到處理前的水平甚至更高。各階段處理組的總細菌、真菌、黃化瘤胃球菌及產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量均低于對照組，但可能因為個體差異導致較大的標準誤差，以上微生物在處理組與對照之間的差異沒有達到顯著的水平。瘤胃灌注絞股藍皂甙對血液總蛋白、總膽固醇、血糖、尿素氮、肌酐的濃度，以及谷草轉氨酶、谷酰轉肽酶和乳酸脫氫

14、酶的酶活無顯著影響，說明長期灌胃絞股藍皂甙對山羊的健康沒有影響?？偠灾g股藍皂甙通過抑制瘤胃中的各種微生物數(shù)量降低瘤胃內(nèi)甲烷的產(chǎn)量，而且對動物的健康沒有負面影響，但是，在長期使用絞股藍皂甙時這種抑制作用逐漸消失，可能的原因是微生物對皂甙產(chǎn)生耐受。
　　3添加不同水平的絞股藍皂甙對傳代培養(yǎng)中甲烷生成、發(fā)酵參數(shù)和重要微生物區(qū)系和數(shù)量的影響
　　本試驗采用體外多次傳代培養(yǎng)及產(chǎn)氣量法，體外研究不同水平的絞股藍皂甙對瘤胃甲烷生成、

15、發(fā)酵特性及微生物區(qū)系和數(shù)量變化的影響。試驗根據(jù)絞股藍皂甙的添加量（0、8、16和24mg/100mL）分為4組。發(fā)酵瓶中的底物為羊草、玉米與豆粕（分別為羊草0.70g、玉米0.20g和豆粕0.10g）。第一代接種物為山羊晨飼前采的10mL用4層紗布過濾的瘤胃液，后面的每代接種物依次為上代的發(fā)酵液，每次均取10mL添加皂甙前傳5代使微生物處于穩(wěn)定期，添加絞股藍皂甙后再傳5代。每個處理組設4個重復，每48h進行一次傳代，每次傳代后的12h、

16、24h和48h測定產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量。每代發(fā)酵結束后迅速測定pH值，然后采集發(fā)酵液樣品測定相關指標。結果顯示，絞股藍皂甙能有效地抑制甲烷產(chǎn)量。發(fā)酵48h高劑量組（16mg和24mg）的累計產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量在第二、第三、第四代顯著低于對照組(P＜0.05)，而且，皂甙劑量間呈顯著和極顯著的線性效應（P＜0.05、P＜0.01）。整個發(fā)酵期，各處理組48h的累計產(chǎn)氣量與甲烷產(chǎn)量呈先降低后上升的趨勢。高劑量處理組（16mg和24mg）48h甲烷

17、產(chǎn)量在發(fā)酵的第三代分別比對照組降低了27.70％和31.08％（最低時）差異顯著(P＜0.05)，而第五代分別降低11.91％和13.10％，但差異不顯著(P＞0.05)。經(jīng)過5代發(fā)酵，各處理組的pH值均高于對照組或相當，但各組之間差異不顯著。除了16mg和24mg處理組氨態(tài)氮濃度在第三和第五代之間顯著的代次差異外(P＜0.01)，氨態(tài)氮和微生物蛋白濃度各處理組和對照組之間沒有顯著差異。發(fā)酵的前四代各處理組總揮發(fā)性脂肪酸濃度均低于對照組

18、，但各組之間的差異不顯著(P＞0.05)，第三、第四代皂甙劑量之間有顯著的線性效應(P＜0.05)。在培養(yǎng)每一代各處理組的乙酸濃度均低于對照組，尤其是高劑量處理組（16mg和24mg）與對照組之間在培養(yǎng)第二、第三和第四代具有顯著的差異(P＜0.05)，而且不同劑量間有顯著的線性效應(P＜0.05)。各組之間丙酸和戊酸濃度沒有發(fā)生規(guī)律性變化。各處理組乙酸/丙酸比例在培養(yǎng)第二、第三和第四代顯著降低，而且不同劑量間有顯著的線性效應(P＜0.0

19、5)，第四代不同劑量間有顯著的二次方效應（P＜0.05）。雖然差異不顯著，高劑量處理組（16mg和24mg）的丁酸濃度均高于對照組和低劑量處理組(8mg)，而異丁酸和異戊酸濃度均低于對照組和低劑量處理組。DGGE分析結果表明，24mg處理組甲烷菌DGGE圖譜上的很多優(yōu)勢條帶在第三、第四代逐漸消失，但在第五代又出現(xiàn)了許多優(yōu)勢條帶，但瘤胃總細菌的DGGE圖譜上無差異性條帶出現(xiàn)。定量PCR結果顯示，高劑量處理組（16mg和24mg）甲烷菌的m

20、crA基因數(shù)量在第二、第三代急劇降低，與對照組之間有顯著差異(P＜0.05)，而且皂甙添加量之間具有顯著(P＜0.05)和極顯著(P＜0.01)的線性效應，但是，從第四代開始呈現(xiàn)逐漸回升的趨勢，第五代時各組之間的差異不再顯著（P＞0.05）。各處理組總細菌數(shù)量均低于對照組，但是差異不顯著(P＞0.05)，第三代在不同添加量之間有顯著的線性效應(P＜0.05)。培養(yǎng)每一代，各處理組黃化瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量均低于對照組，其高劑量