海水弧菌耐藥性調(diào)查及整合子-基因盒系統(tǒng)檢測(cè).pdf

1、近年來(lái),隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展,規(guī)?；⒓s化養(yǎng)殖導(dǎo)致養(yǎng)殖環(huán)境日益惡化,為了防治細(xì)菌性病害,大量的抗菌素被應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程的各個(gè)階段,巨大的選擇壓力導(dǎo)致了養(yǎng)殖水域耐藥細(xì)菌的種類和數(shù)量顯著增加,養(yǎng)殖生物耐藥病原菌病害的發(fā)生也越來(lái)越頻繁。水產(chǎn)源細(xì)菌耐藥性的流行不僅加大了水生動(dòng)物疫病的防控難度,給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失,而且還可通過(guò)食物鏈感染人體或?qū)⒛退幓蜣D(zhuǎn)移至人體病原菌,給食品安全和人體健康帶來(lái)潛在危害。因此,目前迫切需要進(jìn)行水產(chǎn)源細(xì)菌耐

2、藥性監(jiān)測(cè)研究,以促進(jìn)我國(guó)水產(chǎn)源細(xì)菌耐藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與防控的開(kāi)展,保障水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展和食品安全,維護(hù)人體健康。
　　目前,水生細(xì)菌的耐藥性檢測(cè),大部分只是停留在耐藥表型上,主要是采用藥敏紙片、MIC測(cè)定等方法。然而,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,PCR等在耐藥基因的檢測(cè),以及新的耐藥機(jī)制發(fā)現(xiàn)方面發(fā)揮著非常重要作用。
　　本研究首先從上海崇明、江蘇啟東、海南瓊海三地區(qū)海水養(yǎng)殖動(dòng)物和水體收集弧菌樣本,按弧菌科細(xì)菌的鑒定方法對(duì)所采集弧菌鑒

3、定到種。按照美國(guó)臨床試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(National committee for clinical laboratory,NCCLS)推薦的方法和結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn),應(yīng)用紙片擴(kuò)散法(K-B)法測(cè)定了三地區(qū)的分離株對(duì)常用15種抗菌藥物的耐藥情況,從而對(duì)不同地區(qū)養(yǎng)殖水體弧菌分離株的耐藥情況進(jìn)行評(píng)價(jià)分析。然后,根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果,對(duì)于多重耐藥菌株,采用PCR技術(shù)對(duì)其攜帶Ⅰ類整合子情況進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)對(duì)整合子陽(yáng)性菌株攜帶基因盒進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)分兩部分

4、進(jìn)行。
　　1.不同地區(qū)養(yǎng)殖動(dòng)物和水體弧菌分離株耐藥性調(diào)查
　　2009年~2011年間,從上海崇明、江蘇啟東、海南瓊海三地養(yǎng)殖動(dòng)物和水體共分離到弧菌224株,其中上海69株、江蘇84株、海南71株。采用紙片擴(kuò)散法(K-B)對(duì)15種常用抗菌藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果顯示:224株弧菌對(duì)15種抗菌藥物均表現(xiàn)出不同程度的耐藥性,不同地區(qū)分離弧菌對(duì)抗生素的耐藥情況大體一致,但是對(duì)個(gè)別抗生素存在地區(qū)差異。不同地區(qū)的分離株均對(duì)氨基糖苷類,

5、磺胺類的耐藥率較高。三地區(qū)對(duì)妥布霉素、復(fù)方新諾明、新生霉素、利福平的耐藥率均較高(≥60％),對(duì)新霉素的耐藥率維持在較低的水平,較為敏感。三地區(qū)對(duì)壯觀霉素的耐藥率都維持在40%左右。上海、江蘇、海南三地區(qū)分離的菌株對(duì)氨基糖苷類的卡那霉素、新霉素、壯觀霉素都表現(xiàn)出中介值較高的情況,這有可能預(yù)示著耐藥趨勢(shì)的繼續(xù)升高。
　　多重耐藥結(jié)果分析顯示,上海地區(qū)分離菌株多重耐藥率為100%,江蘇地區(qū)分離菌株多重耐藥率為76.2%,海南地區(qū)分離菌

6、株多重耐藥率為77.5%,由此可見(jiàn),海水弧菌的多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重。比較三地區(qū)的多重耐藥結(jié)果,多重耐藥菌株集中在耐3種藥物到7種藥物之間。上海地區(qū),耐7種藥物菌株數(shù)最多,其次為耐4、6種藥物;江蘇地區(qū),耐4種藥物菌株數(shù)最多,其次為耐5種藥物;海南地區(qū),耐5種藥物菌株數(shù)最多,其次為耐3種藥物。
　　2.海水弧菌分離株整合子-基因盒檢測(cè)
　　采用PCR方法擴(kuò)增188株多重耐藥菌株基因組 DNA、質(zhì)粒 DNA上的Ⅰ類整合子的整合酶基因

7、 IntⅠ1、可變區(qū)、3,-保守端。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,有84株基因組 DNA上、56株質(zhì)粒 DNA上檢測(cè)到 IntⅠ1,檢出率分別為44.7%,29.8%,對(duì) IntⅠ1陽(yáng)性菌株進(jìn)行可變區(qū)擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)果顯示,基因組 DNA上有44株擴(kuò)出基因盒片段,質(zhì)粒 DNA上有34株擴(kuò)出基因盒片段。對(duì)可變區(qū) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用Hinf1核酸內(nèi)切酶進(jìn)行酶切,結(jié)果發(fā)現(xiàn),可變區(qū)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度相同,其酶切圖譜也相同,說(shuō)明相同長(zhǎng)度可變區(qū)其攜帶的耐藥基因盒也相同。

8、測(cè)序結(jié)果顯示,所有菌株均擴(kuò)出一種基因盒,即 dfrA12+orf+ aadA2,長(zhǎng)度為1900bp,其編碼對(duì)磺胺類和氨基糖苷類藥物的耐藥。
　　分析Ⅰ類整合子與多重耐藥性的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn):單個(gè)菌株所攜帶的耐藥基因與表型之間并沒(méi)有完全的對(duì)應(yīng)關(guān)系,但整合子在耐藥菌株上的分布相對(duì)比較集中。上海崇明地區(qū),多重耐藥菌株集中在耐4種藥物到7種藥物之間,共有53株,基因組 DNA上有22株檢測(cè)出Ⅰ類整合子、質(zhì)粒 DNA上有15株檢測(cè)出Ⅰ類整合子