貝氏隱孢子蟲在雞胚中發(fā)育史及抗隱孢子蟲藥物篩選研究.pdf

1、隱孢子蟲病是(cryptosporidiosis)一種重要的機(jī)會(huì)性人獸共患原蟲病,自上世紀(jì)80年代起,國內(nèi)外學(xué)者在隱孢子蟲細(xì)胞培養(yǎng)和流行病學(xué)調(diào)查及方面進(jìn)行了大量研究,但目前尚無治療能治療隱孢子蟲病的特效藥物。本研究比較了幾種隱孢子蟲的純化和脫囊方法,旨在建立隱孢子蟲雞胚培養(yǎng)模型,在雞胚培養(yǎng)體系中觀察隱孢子蟲(Cryptosporidium)的內(nèi)生發(fā)育過程,并測(cè)定幾種抗原蟲藥在雞胚體系和雛雞感染試驗(yàn)中對(duì)隱孢子蟲病的治療作用。
　　

2、 一、為獲取純凈的安氏隱孢子蟲卵囊建立其體外培養(yǎng)模型,本試驗(yàn)改進(jìn)了分離純化安氏隱孢子蟲卵囊的方法,采用蒸餾水稀釋Sheather’s蔗糖溶液配制不同密度的蔗糖溶液,比較不同稀釋度的Sheather’s蔗糖溶液漂浮卵囊的效果,并首次比較了蒸餾水和PBS稀釋的Sheather's蔗糖溶液分離純化的卵囊脫囊率。結(jié)果2:1蔗糖溶液(2體積Sheather’s蔗糖溶液與1體積的蒸餾水)漂浮奶牛糞樣中三次即可獲得大量卵囊,回收率為83.70％,漂浮

3、的卵囊數(shù)較Sheather’s蔗糖溶液高101.50％,差異極顯著(P<0.01)。蔗糖溶液多梯度密度純化法純化后的卵囊雜質(zhì)較少,回收率為47.52％。采用同樣方法分離純化的卵囊37℃水浴1h,蒸餾水稀釋的蔗糖溶液分離純化卵囊脫囊率為87.87％,PBS稀釋的蔗糖溶液分離純化卵囊的脫囊率為84.71％,差異不顯著(P>0.05)。本研究表明:2:1蔗糖溶液適用于漂浮安氏隱孢子蟲卵囊,且用蒸餾水代替PBS稀釋Sheather's蔗糖溶分離

4、純化隱孢子蟲卵囊其活性不受影響,可用于體外培養(yǎng)研究。
　　 二、為獲得更多種類純凈的隱孢子蟲卵囊以用于隱孢子蟲體外培養(yǎng)研究,本試驗(yàn)采用蒸餾水代替PBS來稀釋Sheather’s蔗糖溶液,使用不同密度的蔗糖溶液對(duì)卵囊進(jìn)行分離純化,并對(duì)純化后卵囊活性采用孔雀綠染色法、水浴脫囊法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果Candersoni、C.baileyi和C.suis卵囊純化后回收率分別為47.52％、49.55％和41.70％,平均為46.26％,卵囊液

5、中雜質(zhì)很少。純化后卵囊經(jīng)孔雀綠染色活性檢測(cè),活性率分別為97.88％、96.67％和95.14％,平均為96.56％；卵囊37℃水浴1h脫囊活性檢測(cè),脫囊率分別為87.87％、80.03％和81.67％,平均為83.19％,兩種方法檢測(cè)卵囊活性均較高。表明采用蒸餾水代替PBS稀釋Sheather's蔗糖溶液純化卵囊的方法操作簡便,可以為隱孢子蟲體外培養(yǎng)研究提供純凈且活性高的卵囊。
　　 三、為研究不同寄生宿主及不同寄生部位隱孢子

6、蟲的生物學(xué)特征,本試驗(yàn)以Cryptosporidium andersoni、C.baileyi、C.parvum和Chominis為研究對(duì)象,分別選擇在PBS和0.75％膽酸鹽溶液(TDC)中水浴脫囊的方法比較上述4種卵囊脫囊率,并進(jìn)一步比較C.baileyi卵囊在不同溫度及脫囊液中的脫囊率。結(jié)果胃腺寄生的C.andersoni對(duì)溫度敏感,其卵囊在37℃ PBS中即有較高脫囊率,與在37℃0.75％TDC溶液中相比差異不顯著(P>0.0

7、5)。而腸道寄生的C.parvum和C.hominis在37℃ PBS中脫囊率極低,而在37℃0.75％TDC溶液中脫囊率顯著升高(P<0.01)。C.baileyi卵囊在37℃ PBS中有一定脫囊率,與37℃0.75％TDC溶液中脫囊率接近(P>0.05),提高脫囊溫度至40℃,則脫囊率顯著升高并且在PBS和0.75％TDC溶液中卵囊脫囊率差異顯著(P<0.05),但40℃條件下在0.75％、2×0.75％或3×0.75％TDC溶液中

8、卵囊脫囊率差異不顯著(P>0.05)。表明寄生位置不同的隱孢子蟲種類其卵囊對(duì)脫囊條件要求不同:胃腺寄生類群在合適溫度即有較高脫囊率,而腸道寄生類群不僅要求合適溫度,同時(shí)對(duì)脫囊液有很強(qiáng)依賴性。C.baileyi卵囊對(duì)脫囊條件要求更接近于胃腺寄生類群。本研究結(jié)果對(duì)于不同隱孢子蟲種類的體外培養(yǎng)具有一定的指導(dǎo)意義,同時(shí),也證明隱孢子蟲對(duì)脫囊條件的要求與寄生部位有一定的關(guān)系,這對(duì)進(jìn)一步了解隱孢子蟲生物學(xué)特性及體外培養(yǎng)研究有借鑒意義。
　　

9、 四、為研究貝氏隱孢子蟲在雞胚培養(yǎng)體系中的內(nèi)生發(fā)育過程,本試驗(yàn)將純化后的貝氏隱孢子蟲接種于10日齡雞胚尿囊腔,在試驗(yàn)設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)取出雞胚尿囊液及尿囊膜觀察蟲體的發(fā)育狀況。結(jié)果貝氏隱孢子蟲可在雞胚中接種96h后完成整個(gè)發(fā)育史。尿囊膜上蟲體發(fā)育具有聚集性和同步性,新生卵囊多集中于血管附近。對(duì)接種后144h-192h尿囊液中卵囊計(jì)數(shù),認(rèn)為在接種168h尿囊液中卵囊量較大,可進(jìn)行卵囊回收及作為測(cè)定藥物藥物效價(jià)時(shí)間點(diǎn)。這為研究隱孢子蟲發(fā)育史提供支

10、持并為在雞胚培養(yǎng)體系中篩選治療隱孢子蟲病藥物奠定了基礎(chǔ)。
　　 五、為探討復(fù)方磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、地克珠利和阿奇霉素4種藥物對(duì)雞胚和雛雞人工感染模型中雞源貝氏隱孢子蟲作用,篩選有效防治隱孢子蟲病藥物。本試驗(yàn)采用雞胚培養(yǎng)和人工感染雛雞模型,分別以各組雞胚發(fā)育狀況、雞胚中卵囊量:雛雞精神狀態(tài)、排卵囊規(guī)律、體重變化、發(fā)病率、死亡率等為觀察指標(biāo),考察這4種藥物對(duì)隱孢子蟲的作用。結(jié)果使用復(fù)方磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、地克