禽致病大腸桿菌生物被膜檢測(cè)及形成基因研究.pdf

1、禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌（AvianpathogenicEscherichiacoli，APEC）所引起的局部或全身性感染的疾病，并與許多病毒性疾病和其他細(xì)菌性疾病并發(fā)。隨著集約化養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，大腸桿菌病的發(fā)病率和死亡率也隨之增加，抗菌藥物在控制大腸桿菌感染方面發(fā)揮了重要作用，但隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致大腸桿菌耐藥株尤其是多重耐藥菌株不斷出現(xiàn)，致病性大腸桿菌耐藥現(xiàn)象又成為全社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)。細(xì)菌生物被膜（bacterialbi

2、ofilm，BF）作為細(xì)菌重要耐藥的機(jī)制之一，細(xì)菌生物被膜廣泛存在于自然環(huán)境中，具有極強(qiáng)的耐藥性及免疫逃逸性，是造成臨床慢性感染的主要原因之一。禽致病性大腸桿菌生物膜的形成與其耐藥性的變遷和造成慢性感染有直接關(guān)系。禽致病性大腸桿菌生物被膜不僅造成抗菌藥物在獸醫(yī)臨床上的治療失敗，也可通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)人類健康同樣有著極大的威脅。
　　 本試驗(yàn)從吉林省德惠地區(qū)養(yǎng)雞場(chǎng)采集到疑似大腸桿菌病癥狀的58份樣品中分離鑒定出47株禽致病性大

3、腸桿菌（APEC），采用K-B圓紙片法對(duì)分離菌株進(jìn)行卡那霉素敏感株的篩選。共篩選出3株卡那霉素敏感株。另對(duì)其他常用11種抗生藥物進(jìn)行敏感性測(cè)定，結(jié)果表明，分離株對(duì)所有藥物均存在不用程度的耐藥情況。其中耐藥率最高的是四環(huán)素，高達(dá)97.87％；氨芐青霉素、哌拉西林、多西環(huán)素耐藥率也較高，均在90％以上。且所有菌株均為多重耐藥株，其多重耐藥情況為少于七耐菌株占19.15％（9/47）、八耐菌株占10.64％（5/47）、九耐菌株占12.77％

4、（6/47）、十耐菌株占19.15％（9/47）、十一耐菌株占21.27％（10/47）、十二耐菌株占17.02％（8/47）。
　　 對(duì)3株卡那霉素敏感株進(jìn)行生物被膜定性觀察和定量檢測(cè)表明APEC-8能形成強(qiáng)生物被膜，適合作為接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)的受體菌。為后續(xù)試驗(yàn)方便篩選，對(duì).APEC-8進(jìn)行宿主體外生物被膜形成條件的優(yōu)化，確定其最適形成條件是37℃培養(yǎng)48h，培養(yǎng)基為5％TSB、粘附介質(zhì)為U底96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（材質(zhì)為聚苯乙烯），C

5、orningCostar公司產(chǎn)品。以改造的大腸桿菌E.coliβ2155（pUT-miniTn5-Km2）為供體菌與受體菌APEC-8進(jìn)行雙親本濾膜轉(zhuǎn)移接合雜交5次，構(gòu)建五個(gè)轉(zhuǎn)座插入突變體庫(kù)，并傳代3次獲得穩(wěn)定的接合子共計(jì)269個(gè)；PCR擴(kuò)增鑒定具有卡那抗性的陽(yáng)性菌株為193個(gè)；通過(guò)優(yōu)化后的條件定量檢測(cè)193株突變株的生物被膜形成情況，從中篩選出4株生物被膜缺陷突變株。利用基因組步移PCR技術(shù)擴(kuò)增4株生物被膜缺陷突變株卡那抗性基因側(cè)翼序