離子束輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)抗赤霉病基因tri101轉(zhuǎn)化小麥成熟胚的初步研究.pdf

1、小麥?zhǔn)俏覈闹饕Z食作物，它不僅是人類的重要食物來源，還是畜牧業(yè)中飼料的重要來源，另外它還是許多輕工業(yè)產(chǎn)品的重要原料。然而赤霉病等小麥病害嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人民生活帶來巨大的損害。赤霉病產(chǎn)生的DON毒索還危及人類食品和動物飼料的安全，對人類和動物的身體健康造成危害。tri101基因是降解赤霉病菌毒素的一個主要結(jié)構(gòu)基因，它在植物中的表達(dá)不僅可以降低赤霉病的發(fā)病率，還能減少真菌毒素的積累，從而降低赤霉病對小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的

2、影響。通過基因工程的方法，使tri101基因在小麥中高效表達(dá)，可以提高小麥抗病功能，減輕赤霉病毒素對小麥生長的危害，有望增加小麥的產(chǎn)量和質(zhì)量，創(chuàng)育出超高產(chǎn)的小麥品種。本研究將降解赤霉病菌毒素基因tril01基因與pCAMBIA1304載體融合，構(gòu)建了小麥轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1304-tri101并轉(zhuǎn)化小麥，以期該基因在小麥里特異表達(dá)，從而提高小麥抗病功能，減輕赤霉病毒素對小麥生長的危害。同時，我們選擇一個比較新的植物轉(zhuǎn)基因方法--離子

3、束介導(dǎo)法，并探討了真空處理和離子劑量這兩個重要因素對小麥出苗率和種子活力的影響，以期探索一種更完善、快捷的轉(zhuǎn)基因方法，為植物遺傳轉(zhuǎn)化和新品種改良提供幫助。現(xiàn)將本研究的主要結(jié)果報道如下：
　　 1．小麥轉(zhuǎn)化表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 將降解赤霉病菌毒素基因tri101基因與pCAMBIA1304載體融合，構(gòu)建了小麥轉(zhuǎn)化表達(dá)載體pCAMBIA1304-tri101。采用凍融法將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株LBA4404。

4、
　　 2．不同離子注入?yún)?shù)對小麥出苗的影響研究
　　 探討了真空處理和離子劑量這兩個重要因素對小麥出苗率和種子活力的影響，發(fā)現(xiàn)真空處理對小麥出苗率和種子活力影響均不大，離子劑量對出苗率的影響明顯，低劑量的處理對種子出苗率影響較小，隨著劑量增加，出苗率程直線下降。通過比較，得到適合進(jìn)行小麥基因轉(zhuǎn)化的最佳參數(shù)：真空度10-3～10-2pa、能量30kev、束流200mA、脈寬400μs、頻率25Hz、劑量為8×1017N+

5、/cm2，真空處理時間2～3h。
　　 3．離子束介導(dǎo)tri101基因轉(zhuǎn)化小麥
　　 使用離子束對小麥胚部進(jìn)行照射處理，然后通過農(nóng)桿菌侵染將外源基因tri101整合到小麥細(xì)胞中。對侵染后的小麥進(jìn)行土培法和組培法兩個處理，經(jīng)Gus組織化學(xué)染色和PCR檢測，在20000粒進(jìn)行土培法處理的種子中得到22株部分葉片或根部轉(zhuǎn)化成功的植株，轉(zhuǎn)化率為0.11％；在5000粒進(jìn)行組培法處理的種子中得到2株轉(zhuǎn)化成功的植株，轉(zhuǎn)化率為0.04