蛋白質(zhì)生化技術(shù)

1、蛋白質(zhì)生化技術(shù),南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院Protein Biochemistry Lab Nankai University 葉麗虹,SELDI蛋白指紋技術(shù)GST Pull-Down報(bào)告基因系統(tǒng)PTDs,蛋白質(zhì)芯片-飛行質(zhì)譜系統(tǒng)及其在分子生物學(xué)中的應(yīng)用,背景介紹,蛋白指紋質(zhì)譜技術(shù)（SELDI，Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization，表面增強(qiáng)激光解吸技術(shù)）是

2、2002年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的核心技術(shù)，具有快速、簡(jiǎn)單和靈敏等優(yōu)點(diǎn),它不僅可在腫瘤診斷中用于發(fā)現(xiàn)標(biāo)志物、觀察治療效果,還可用于研究蛋白質(zhì)的修飾、相互作用、信號(hào)傳導(dǎo)和酶促調(diào)節(jié)等,從而實(shí)現(xiàn)在蛋白質(zhì)水平的大規(guī)模功能研究。,傳統(tǒng)蛋白組學(xué)研究（2D-MS）的局限性,由于外加電場(chǎng)下的PH梯度不穩(wěn)定，重復(fù)性差 加樣量小，分離的蛋白質(zhì)很難鑒定可分析的蛋白質(zhì)最多約1500種，難以檢出蛋白質(zhì)中占很大比例的低豐度蛋白質(zhì)對(duì)于分離跨膜蛋白仍是技術(shù)難點(diǎn)電泳膠上的

3、蛋白質(zhì)斑點(diǎn)很大部分包含一種以上蛋白，以依次鑒定單個(gè)蛋白斑點(diǎn)為基礎(chǔ)，限制了檢測(cè)通量消耗時(shí)間長(zhǎng)，一次電泳要5小時(shí)以上 對(duì)技術(shù)水平要求高，不能完全自動(dòng)化染色轉(zhuǎn)移等環(huán)節(jié)操作技術(shù)條件要求高，耗時(shí)，不適應(yīng)于大規(guī)模篩查和臨床檢測(cè),SELDI技術(shù)的優(yōu)勢(shì),直接用粗生物樣品（血清、尿、體液）進(jìn)行分析 同時(shí)快速發(fā)現(xiàn)多個(gè)生物標(biāo)記物微量樣品 (as few as 2000 cells for LCM samples)高通量的驗(yàn)證能力（ with 1

4、000s of samples a month）發(fā)現(xiàn)低豐度蛋白質(zhì) 測(cè)定疏水蛋白質(zhì): 與“雙相電泳加飛行質(zhì)譜”相比，除了有相似功能外，并可增加測(cè)定疏水蛋白質(zhì)在同一系統(tǒng)中集發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)為一體,特異性高 ：利用單克隆抗體芯片，可鑒定未知抗原/蛋白質(zhì)，以減少測(cè)定蛋白質(zhì)序列的工作量可以定量：利用單克隆抗體芯片，由于結(jié)合至芯片上的抗體是定量的，故可以測(cè)定抗原量，但一般飛行質(zhì)譜不用于定量分析功能廣 ： I.利用單克隆抗體芯片, 可替代

5、 Western Blot II. 利用單克隆抗體芯片, 可互補(bǔ)流式細(xì)胞儀不足的功能，如將細(xì)胞溶解，可測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的抗原, 而且靈敏度遠(yuǎn)高于流式細(xì)胞儀,系統(tǒng)介紹,SELDI技術(shù)的蛋白質(zhì)芯片－飛行時(shí)間質(zhì)譜儀器由三部分組成：蛋白質(zhì)芯片閱讀器（Protein Chip Reader）飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)系列（PBSIIC系列）分析軟件（Protein Chip軟件）。,操作流程示意圖,生物初樣品（血清/細(xì)胞裂解液）：蛋白質(zhì)通過(guò)親

6、合作用結(jié)合到芯片的化學(xué)或生物位點(diǎn)上；清洗蛋白質(zhì)芯片：用水洗去非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和緩沖液中的雜質(zhì)，以消除干擾；加能量吸收分子 EAM（Energy Absorb Molecule） or “Matrix”：芯片 經(jīng)室溫干燥后，加能量吸收分子 EAM到每個(gè) 點(diǎn)上，使其與蛋白質(zhì)結(jié)成混合晶體，以促進(jìn)蛋白質(zhì)在飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)中的解吸附和離子化,,,,SELDI蛋白質(zhì)芯片的制備,1,2,3,,,飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè),激光解吸電離的方法將保留在芯

7、片上的蛋白質(zhì)解離出來(lái)電離的蛋白質(zhì)可以通過(guò)飛行時(shí)間質(zhì)譜被精確地測(cè)定出它們的質(zhì)量,Protein Chip Reader工作草圖,,Protein Chip 軟件,化學(xué)表面芯片,分為疏水、親水、陽(yáng)離子、陰離子和金屬離子螯合芯片五種，用于檢測(cè)未知蛋白，獲取指紋圖譜。化學(xué)表面芯片可以直接用粗生物樣品（血清、尿樣、體液）進(jìn)行分析，能同時(shí)快速發(fā)現(xiàn)多個(gè)生物標(biāo)記物，測(cè)定疏水蛋白質(zhì)特別是膜蛋白。,芯片的種類,生物表面芯片,生物表面芯片分為抗體－抗原、

8、受體－配體和DNA－蛋白質(zhì)芯片等種類，可顯示與之相結(jié)合的抗原或者配體的不同分子量亞型，這種芯片的特異性高，可以定量。,蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)提供了一個(gè)單一、快速和特異的平臺(tái)，成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的多個(gè)領(lǐng)域的強(qiáng)大平臺(tái)。 能夠用于下列研究：生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)、表達(dá)差異繪圖、作用差異繪圖、抗體抗原作用、DNA與蛋白的相互作用、蛋白鑒定和多肽作圖、蛋白質(zhì)純化、表位作圖、糖基化分析、磷酸化/信號(hào)傳導(dǎo)途徑分析、蛋白與蛋白之間作用、受體配體作用、毒性標(biāo)

9、志物發(fā)現(xiàn)、臨床數(shù)據(jù)分析等。,在發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物上的優(yōu)勢(shì),抓住了疾病的本質(zhì)，絕大多數(shù)疾病都有特異的生物標(biāo)志物（Bio-marker），在SELDI技術(shù)中質(zhì)譜的峰值是對(duì)這些生物標(biāo)志物最直接的反映。有一套靈敏的檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)和識(shí)別這些微量的生物標(biāo)志物 。,發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物,能夠?qū)υS多不同的樣品進(jìn)行比較分析，軟件功能強(qiáng)大，分析獲得的譜圖可以多種形式表示，并應(yīng)用疊加合成等手段篩選出特別的差異峰，從而確定生物標(biāo)志物，該方法迅速便捷。,蛋白質(zhì)純化,提

10、供了便捷的蛋白質(zhì)純化方法，能夠優(yōu)化最佳色譜條件（如PH值、洗脫條件），對(duì)目的蛋白質(zhì)進(jìn)行有效的分離。,蛋白質(zhì)鑒定,從蛋白質(zhì)芯片對(duì)結(jié)合的蛋白質(zhì)進(jìn)行消化，或者事先對(duì)蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行蛋白酶切處理，再結(jié)合到蛋白質(zhì)芯片。結(jié)合質(zhì)譜分析，能夠得到消化片段的分子量，從數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索就能夠獲得相應(yīng)蛋白質(zhì)的序列信息。,分子間作用,預(yù)先對(duì)芯片的點(diǎn)進(jìn)行處理，偶聯(lián)抗體或者其他蛋白（或者其他的誘餌分子），制備定制芯片。將待檢測(cè)包含可能結(jié)合分子的溶液與芯片進(jìn)行雜交，

11、洗脫后對(duì)結(jié)合上的綁定蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲得結(jié)合蛋白質(zhì)的相關(guān)信息。,轉(zhuǎn)錄后修飾,能夠確定樣品中特定分子量的蛋白質(zhì)，而這些蛋白質(zhì)的各種修飾對(duì)分子量的改變導(dǎo)致了獲得相應(yīng)峰的位移，從而精確表述蛋白質(zhì)的修飾狀況。,臨床應(yīng)用,蛋白質(zhì)指紋質(zhì)譜技術(shù)目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種疾病，如癌癥、老年病、傳染性疾病、心血管病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床診斷，其中應(yīng)用于癌癥的最多，被認(rèn)為是分子醫(yī)學(xué)的一場(chǎng)革新，極大的提高了各種疾病的診斷率。,疾病的診斷、療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷,腫

12、瘤：前列腺癌 乳腺癌 卵巢癌 膀胱癌 白血病 肺癌 腦癌 大腸癌其它疾?。杭毙阅I功能衰竭 急性心力衰竭, 動(dòng)脈硬化癥 暴露在空氣中的毒素神經(jīng)精神病學(xué) ：早老性癡呆 憂郁癥 精神分裂癥 巴金森氏 Huntington’s 傳染?。篐IV 鼠疫桿菌Yersinia pestis 分支桿菌Mycobacterium 柄細(xì)菌Caulobacter 鏈球菌Streptococcus 肉毒中毒Botulism 盶病毒Prions 黑死病病毒

13、Yersinia,臨床診斷腫瘤,肝癌 甲胎蛋白AFP 91% 89% 肺癌 NSE 82% 95% 胃癌 癌胚抗原CEA 91%

14、 94% 前列腺癌 PSA 83% 97% 乳腺癌 癌抗原CA153 93% 91% 卵巢癌 癌抗原CA125 99%

15、 99% 腸癌 癌胚抗原CEA 83% 92% 胰腺癌 CA199 82% 85% 膀胱癌 尿液檢測(cè) 93%

16、 87% 鼻咽癌 92% 97% 食道癌 84% 91% 喉癌

17、 97% 97%,腫瘤 傳統(tǒng)標(biāo)志物 靈敏度 特異性,,SELDI腫瘤蛋白指紋,,,發(fā)病機(jī)理研究,著名的艾滋病學(xué)家何大一教授借助SELDI技術(shù)，在3個(gè)月內(nèi)所定了α-defensin 1，2，3 三種蛋白對(duì)艾滋病有抑制作用，這是正常人體內(nèi)沒(méi)有的蛋白質(zhì)，這一發(fā)現(xiàn)使研制艾滋病蛋白抑制劑一直成為可能。乙肝病毒感

18、染-肝硬化-肝癌是導(dǎo)致乙肝患者最終死亡的發(fā)病三步曲，通過(guò)SELDI，檢測(cè)乙肝病毒攜帶者、肝硬化及肝癌病人的血清蛋白，發(fā)現(xiàn)三種疾病的質(zhì)譜峰，檢測(cè)其它樣品時(shí)靈敏度為80%，特異性為81.8%，這種手段無(wú)創(chuàng)傷，并且可以不間斷的跟蹤檢測(cè)，為正確治療提供科學(xué)可靠的技術(shù)依據(jù)。,其他應(yīng)用,新藥開(kāi)發(fā)與藥理學(xué)研究，藥物毒性實(shí)驗(yàn)等，利用SELDI技術(shù)可以準(zhǔn)確的側(cè)到藥物中的特異基因，活性基因與滅活基因。對(duì)臨床用藥具有很好的有指導(dǎo)作用 ?；A(chǔ)理論研究：蛋白

19、質(zhì)的純化，蛋白質(zhì)的鑒定，蛋白質(zhì)功能的研究，已知樣品中某種功能蛋白，可通過(guò)該技術(shù)尋找功能蛋白。蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用研究，如有已知抗體、受體酶，可用該技術(shù)獲得其靶蛋白（抗原、配體和底物），形成DNA或者RNA結(jié)合蛋白的研究，確定抗原決定簇，蛋白質(zhì)磷酸化，糖基化研究，用于尋找與疾病有關(guān)的磷酸化，蛋白及新型生物標(biāo)志物的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用等。,GST Pull-Down（谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶沉淀試驗(yàn)）方法尋找結(jié)合蛋白,Protein Biochemis

20、try Lab Nankai University,背景,蛋白質(zhì)間相互作用的研究作為了解蛋白質(zhì)生物功能的重要手段之一，在功能基因組學(xué)研究中極為重要。蛋白質(zhì)間相互作用存在于機(jī)體每個(gè)細(xì)胞的生命活動(dòng)過(guò)程中。生物學(xué)中的許多現(xiàn)象如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和癌變等均受蛋白質(zhì)間相互作用的調(diào)控。,Protein Biochemistry Lab Nankai University,簡(jiǎn)介,GST Pull-down技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展的一種敏感性及

21、特異性均較高的體外鑒定兩蛋白之間相互作用的重要方法1991年由Kaelin的研究組最早應(yīng)用GST Pull-down技術(shù)在混合蛋白溶液尋找到結(jié)合蛋白利用谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）融合蛋白對(duì)谷胱甘肽偶聯(lián)球珠的親和性，從可能含有相互作用蛋白的溶液中純化相互作用的蛋白,Protein Biochemistry Lab Nankai University,實(shí)驗(yàn)步驟,原核表達(dá)并純化GST融合

22、的已知蛋白。同時(shí)，應(yīng)用放射性同位素（ 35S）對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行標(biāo)記。將GST融合蛋白與標(biāo)記好的細(xì)胞裂解物混合，同時(shí)加入谷胱甘肽偶聯(lián)球珠，溫浴使得融合蛋白的GST能夠與球珠結(jié)合。通過(guò)離心方法收集GST融合蛋白以及與其結(jié)合的可能的蛋白分子 。在收集到的混合物中加入谷胱甘肽或者直接煮沸，使得目的的混合物能夠從球珠上洗脫下來(lái)，溶解在SDS-PAGE 上樣緩沖液中。將獲得的混合物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，進(jìn)行放射自顯影或者蛋白染色，進(jìn)而

23、轉(zhuǎn)膜進(jìn)行Western blotting 實(shí)驗(yàn)鑒定。還可應(yīng)用質(zhì)譜的方法對(duì)找到的結(jié)合蛋白進(jìn)行分析，確定未知蛋白的氨基酸組成，從而找到與已知蛋白結(jié)合的因子。,Protein Biochemistry Lab Nankai University,應(yīng)用,確定融合蛋白與未知蛋白間新的相互作用證實(shí)融合蛋白與已知蛋白質(zhì)間可能的相互作用,Protein Biochemistry Lab Nankai University,GST Pull-Dow

24、n檢測(cè)蛋白的作用,原核表達(dá)的已知蛋白細(xì)胞裂解液中的未知蛋白質(zhì)應(yīng)用cDNA文庫(kù)，進(jìn)行體外翻譯的蛋白質(zhì)文庫(kù)中的未知蛋白半定量檢測(cè)蛋白與蛋白的親和作用,Protein Biochemistry Lab Nankai University,GST,Protein X,GST,,,,,,,35S-labled cell lysate,(glutathione-sepharose beads),(glutathione-sepharose b

25、eads),35S-labled cell lysate,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,GST,Protein X,GST,GST,,,,,,,Interact at 40C,,,Microfuge to collect complexes,Protein Biochemistry Lab Nankai University,實(shí)驗(yàn)步驟,,,,,,,,,,,,1 2 3,autoradiograph,

26、Analyze by SDS-PAGE,Lane1. MarkerLane2. GST-proteinXLane3. GST,,,,GST,,,,GST,Protein X,,,,Protein Biochemistry Lab Nankai University,實(shí)驗(yàn)步驟,,,,,,,Protein Biochemistry Lab Nankai University,Protein Biochemistry Lab Nankai

27、 University,GST pull down驗(yàn)證兩種已知蛋白質(zhì)的相互作用,舉 例,,input,GST,Y-GFP + + +,X-GST,,Y-GFP,X-GFP + + +,GST,input,,105kD,Anti-GFP,Anti-GFP,Y-GST,X-GFP,Protein Biochemistry Lab Nankai University

28、,報(bào)告基因系統(tǒng),,gene；luciferase；green fluorescent protein 報(bào)告基因(report gene)是指一組編碼易被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因，將其與目的基因融合表達(dá)后，可通過(guò)報(bào)告基因產(chǎn)物的表達(dá)來(lái)“報(bào)告”目的基因的表達(dá)調(diào)控。這項(xiàng)技術(shù)靈敏度高、檢測(cè)簡(jiǎn)便可靠、適于大規(guī)模生產(chǎn)，因而在監(jiān)測(cè)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，基因表達(dá)和藥物篩選等方面得到廣泛應(yīng)用。一般的報(bào)告基因需要滿足以下幾個(gè)條件：(1)基因被克隆并且已知全序列；(2)

29、宿主不存在報(bào)告基因產(chǎn)物或者不存在類似的內(nèi)源性物質(zhì)；(3)表達(dá)產(chǎn)物易被檢測(cè)；(4)報(bào)告分子的分析結(jié)果應(yīng)具有很寬的線形圍，以便分析啟動(dòng)子活性的幅度變化?；(5)報(bào)告基因在細(xì)胞或動(dòng)物內(nèi)表達(dá)對(duì)其正常的生理作用或活性沒(méi)有影響?，F(xiàn)主要以目前應(yīng)用最廣泛的報(bào)告基因熒光素酶和綠色熒光蛋白為例，綜述報(bào)告基因的新近應(yīng)用研究進(jìn)展。1 熒光素酶(1uciferase，luc) luc是能催化熒光素或者脂肪醛氧化發(fā)光的一類酶的總稱。根據(jù)來(lái)源不同主要分為細(xì)菌熒光素酶

30、(bacterial luciferase，BL)、螢火蟲(chóng)熒光素酶(firefly luciferase，F(xiàn)L)以及以海星、發(fā)光魚(yú)、發(fā)光甲蟲(chóng)等為來(lái)源的熒光素酶，目前研究最廣泛并且成為商品酶的是BL和FL。,報(bào)告基因的研究背景,要研究基因的功能，基因的調(diào)控機(jī)制非常重要，基因的表達(dá)產(chǎn)物很復(fù)雜并難以準(zhǔn)確的定量和定性。研究報(bào)告基因系統(tǒng)成為一種簡(jiǎn)單的研究基因調(diào)控的方法。對(duì)真核基因調(diào)控的了解，主要來(lái)自野生型和突變型的假定順式作用調(diào)控元件的活性測(cè)定

31、實(shí)驗(yàn)，是在轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞中進(jìn)行的。在大多數(shù)情況下不直接測(cè)定調(diào)控元件的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄速率的能力,而是把順式調(diào)控元件與一種編碼新的產(chǎn)物的,被稱為報(bào)告基因的基因序列連接起來(lái),在基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中,測(cè)定報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的量,來(lái)判斷順式調(diào)控元件的調(diào)控能力。,一般的報(bào)告基因需要滿足以下幾個(gè)條件：基因被克隆并且已知全序列；宿主不存在報(bào)告基因產(chǎn)物或者不存在類似的內(nèi)源性物質(zhì)；報(bào)告基因編碼的產(chǎn)物的檢測(cè)應(yīng)該快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高而且重現(xiàn)性好；細(xì)胞內(nèi)其它的基因

32、產(chǎn)物不會(huì)干擾報(bào)告基因產(chǎn)物的檢測(cè)。報(bào)告基因的表達(dá)同樣也不能影響或改變細(xì)胞正常的生理活性。報(bào)告分子的分析結(jié)果應(yīng)具有很寬的線形圍，以便分析啟動(dòng)子活性的幅度變化；報(bào)告基因在細(xì)胞或動(dòng)物內(nèi)表達(dá)對(duì)其正常的生理作用或活性沒(méi)有影響。,報(bào)告基因通常是在報(bào)告基因載體質(zhì)粒中與被檢測(cè)基因序列相連, 提取大腸桿菌中擴(kuò)增的質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染入目的真核細(xì)胞中。與此同時(shí)還要將一有真核啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的另一種報(bào)告基因質(zhì)粒,共轉(zhuǎn)染同一細(xì)胞,以作為轉(zhuǎn)染率的內(nèi)對(duì)照。

33、目前已有很多的方法用于報(bào)告基因的測(cè)定如: 比色法、熒光法、生物發(fā)光法、化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法及原位染色法及流式細(xì)胞儀法。,報(bào)告基因的種類 氯霉素轉(zhuǎn)乙酰酶報(bào)告基因(chlormnphenicol acetyl transferase,CAT) 細(xì)菌的CAT酶能將乙?；鶑囊阴］o酶Ａ轉(zhuǎn)移到氯霉素上,而使其失去抗菌性。該反應(yīng)能通過(guò)測(cè)量放射性標(biāo)記的底物而量化。放射性同位素標(biāo)記底物有3Ｈ標(biāo)記的乙酰輔酶Ａ

34、和14Ｃ標(biāo)記的氯霉素或用熒光素標(biāo)記其中之一。CAT抗體可用于ELISA法檢測(cè)CAT。 優(yōu)點(diǎn)：在真核細(xì)胞中的本底很低；結(jié)果的重現(xiàn)性很好；靈敏度很高。 缺點(diǎn)：只能用細(xì)胞提取物進(jìn)行測(cè)定；測(cè)定的范圍很窄；可能有放射性同位素的污染。,β 半乳糖苷酶報(bào)告基因(βgalatosidase,β gal) 大腸桿菌編碼的βgal能水解乳糖為半乳糖。雖然在很多細(xì)菌、植物和動(dòng)物細(xì)胞中存在較高的本底,而

35、限制了它的使用,但常用做轉(zhuǎn)染的參照體系。通過(guò)使用特定的方法,還能夠區(qū)別內(nèi)外源性的β gal(改變緩沖液的ｐＨ等) 檢測(cè)方法:比色法、熒光法、化學(xué)發(fā)光法、FACS等。,β 葡萄糖苷酸酶(β glucuronidase,β GUS)報(bào)告基因 是大腸桿菌的又一水解酶,它能水解葡萄糖苷酸。 主要用于缺乏該酶的病毒性植物病原體、植物、酵母、及真菌等的研究中,在醫(yī)學(xué)研究中相對(duì)應(yīng)用較少。 相關(guān)產(chǎn)品

36、 ICN公司的Aurora GUS試劑盒 ，應(yīng)用了MUG(4 methylumbelliferyl β D glucuronide)使實(shí)驗(yàn)的靈敏度比同類的熒光分析更加靈敏，且能使存在動(dòng)植物細(xì)胞中的熒光本底降低很多,分泌型堿性磷酸酶(Secreted alkaline phosphatase, SEAP)報(bào)告基因 該酶為人胎盤堿性磷酸酶(PLAP)的突變體,也有從北大西洋海域中的耐熱細(xì)菌中分離出耐熱型AP。

37、 由于該酶能分泌到細(xì)胞外,在檢測(cè)時(shí),可以在不破壞細(xì)胞的情況下,任意時(shí)間都可以取細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行重復(fù)的、動(dòng)態(tài)的檢測(cè), 還可以用做其它的用途。,熒光素酶(luciferase, luc)報(bào)告基因　 該酶克隆于北美洲螢火蟲(chóng)的熒光素酶基因,它能催化甲蟲(chóng)的熒光素的氧化性羧化作用,發(fā)射出光子,能被光度計(jì)或閃爍計(jì)數(shù)器捕獲定量。 快速、方便,更具有很好的濃度線性范圍(具有7～8個(gè)數(shù)量級(jí)的線性范圍),而被廣泛應(yīng)用。

38、 能在合成時(shí)與蛋白產(chǎn)生融合蛋白,該酶的檢測(cè)靈敏度達(dá)10-20 mol,且該酶的半衰期很短,在評(píng)價(jià)基因的表達(dá)物的誘導(dǎo)效應(yīng)的瞬間分析中具有較好的效果。 在化學(xué)反應(yīng)中通過(guò)降低反饋抑制而使信號(hào)更加穩(wěn)定,使其檢測(cè)可以用液閃法或光照度計(jì)法進(jìn)行檢測(cè)。,綠色熒光蛋白(GFP）報(bào)告基因　 該基因來(lái)源于西北太平洋海域的水母。該蛋白在紫外光下發(fā)射熒光,而可以被多種方法檢測(cè)。該報(bào)告基因檢測(cè)不需要底物。 綠熒光蛋白在加熱

39、、變性劑、去垢劑及一般的蛋白酶均不能使它滅活?？捎脽晒怙@微鏡或熒光激活的FACS進(jìn)行檢測(cè), 能在活細(xì)胞條件下觀測(cè),而且能進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)的定位分析。能在轉(zhuǎn)基因小鼠中以無(wú)害的形式整合于小鼠的DNA中。,報(bào)告基因的應(yīng)用,啟動(dòng)子活性分析基因轉(zhuǎn)移分析信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性檢測(cè)受體功能鑒定細(xì)胞毒性檢測(cè)生物大分子的相互作用藥物開(kāi)發(fā)的生物篩選,蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)或細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽 (PTDs),細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽,◆ 概念,一些蛋白質(zhì)如HI

40、V 的TAT蛋白、果蠅轉(zhuǎn)錄因子Antp、HBV的前S抗原等可以進(jìn)入細(xì)胞。其特定結(jié)構(gòu)域（一般10-30個(gè)氨基酸）對(duì)其進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮主要作用。如果將這一結(jié)構(gòu)域可以攜帶生物大分子以非受體依賴方式進(jìn)入細(xì)胞。這些具有攜帶生物大分子進(jìn)入細(xì)胞的多肽統(tǒng)稱為細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽（Transduction peptide）或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能區(qū)（protein transduction domain, PTD）。,,◆病毒蛋白TAT和VP22從感染細(xì)胞到非感染細(xì)胞的擴(kuò)散。

41、◆蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的可能作用機(jī)制：非受體特異性的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 經(jīng)典的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑：受體---運(yùn)輸小體---內(nèi)涵體（或胞飲作用） 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)：富含精氨酸和賴氨酸的蛋白結(jié)構(gòu)易于和帶負(fù)電 的磷脂膜結(jié)合。轉(zhuǎn)導(dǎo)的非折疊構(gòu)象進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)重新再折疊。,◆三種主要的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)：HIV-1 TAT, HSV VP22, Antp Antp所能結(jié)合并轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)的蛋白大于100氨基酸； TAT, VP22可攜帶大于1000個(gè)氨基酸,蛋白

42、轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的三種產(chǎn)生途徑,■蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中肽段的人工合成：并且與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié) 構(gòu)域結(jié)合的肽段可交聯(lián)成大蛋白。■轉(zhuǎn)染TAT或VP22的表達(dá)載體于細(xì)胞中，融合蛋白在細(xì) 胞中表達(dá)，在由原始的轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌而進(jìn)入周圍未 轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 ■TAT融合蛋白在細(xì)菌中大量表達(dá)，分離純化后加到培 養(yǎng)液中。,TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),( A )構(gòu)建原核表達(dá)載體----將表達(dá)TAT的基因片段與目的蛋白的基因片段連接,TAT融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)

43、建,(B) TAT融合蛋白的大規(guī)模純化 裂解并用尿素變性后分離純化出需要的融合蛋白(應(yīng)用8 M 尿素或者6M的鹽酸胍能夠有效的破壞細(xì)菌的包涵體，使所需的重組融合蛋白能夠釋放).純化的融合蛋白是變性的，但是一旦轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)部的HSP90等分子伴侶的作用下，就能夠正確折疊具有活性功能的蛋白.,(C) 融合蛋白表達(dá)分析 1. 構(gòu)建好的融合蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至 BL21菌種。 2. 從轉(zhuǎn)化的平板上挑出6-12個(gè)單菌落，各自在1

44、ml的Amp抗性 LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中含有誘導(dǎo) 劑(IPTG)，濃度為100 μM。 3. 將菌體離心沉淀并重懸于 2×SDS 的樣品緩沖液中，通過(guò)SDS–PAGE電泳進(jìn)行融合蛋白表達(dá)的分析，挑選出融合蛋白表達(dá)最多的菌種。 4. 將SDS–PAGE電泳的膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，應(yīng)用HA標(biāo)簽的抗體或者所融合目的蛋白的抗體進(jìn)行Western-blotting證實(shí)融合蛋白的表達(dá)。,( D )蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)以及檢測(cè)■ 應(yīng)

45、用Fluorescein (FITC)等標(biāo)記轉(zhuǎn)導(dǎo)的融合蛋白,采用熒光顯微鏡或者流式細(xì)胞儀技術(shù)可以對(duì)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行檢測(cè)或分選?！?采用免疫組化可能對(duì) TAT融合蛋白進(jìn)行定位?！?現(xiàn)在已有了TAT-GFP載體，在融合蛋白中構(gòu)建了綠色熒光蛋白，能夠?qū)Φ鞍邹D(zhuǎn)導(dǎo)示蹤。,蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)與基因轉(zhuǎn)染的比較（優(yōu)點(diǎn)）：,■ 轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高：所有的真核細(xì)胞均能被蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括有 壁的酵母細(xì)胞，原代培養(yǎng)的細(xì)胞和所有基因轉(zhuǎn)染和逆病 毒轉(zhuǎn)染效率低的

46、細(xì)胞。■ 發(fā)生作用快，在無(wú)血清的培養(yǎng)液中15分鐘內(nèi)起效?！?可定量，細(xì)胞內(nèi)的融合蛋白濃度可嚴(yán)格控制。■ 轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中宿主細(xì)胞損傷較小■ 融合蛋白還能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)入活體動(dòng)物的細(xì)胞和各個(gè)組織，并 具備有穿越血腦屏障的能力可轉(zhuǎn)導(dǎo)整個(gè)動(dòng)物體。,蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)與基因轉(zhuǎn)染的比較（缺點(diǎn)）：,■ 可攜帶的目的蛋白15-120KDa?！?有部分融合蛋白在細(xì)菌表達(dá)體系中產(chǎn)量低，且缺 少轉(zhuǎn)錄后修飾。■ 融合蛋白的定位差?！?作用時(shí)間短，6天