黑曲霉糖化酶淀粉結合區(qū)環(huán)化重排及其對糖化酶生淀粉降解性能的影響.pdf

1、淀粉酶可以水解普通淀粉，但只有百分之十的淀粉酶可以結合并分解生淀粉。糖化酶(Glucoamylase，GA)是一類具有特殊生淀粉結合能力的淀粉水解酶，該類淀粉酶具有一類重要的結構域，淀粉結合區(qū)(Starch-binding Domain，SBD)。SBD具有重要的工業(yè)應用價值:在糧食加工和淀粉液化過程中，選擇性地去除織物中的淀粉，重組蛋白質的親和純化和提高非淀粉分解酶的效率。但是在工業(yè)應用中因為發(fā)酵過程中糖化酶(GA)的表達量偏低以及雜

2、蛋白的存在，其分離純化較困難。此外現(xiàn)有的生淀粉降解酶活性不足，需要通過高溫蒸煮，經過糊化、糖化過程才能利用生淀粉，造成能量消耗偏大、成本過高。這使得我們迫切需要構建表達量高，分離純化簡單，能耗小且生淀粉降解酶活性較高的重組菌株。
　　蛋白質環(huán)化重排是通過共價連接氨基端和羧基端，裂解某個鈦鍵重新獲得新的N-末端和C-末端的過程。通過環(huán)化重排處理之后能夠提高蛋白質催化能力和配體親和性[86,87]，改變底物選擇性[88,89]，改變低

3、聚反應狀態(tài)[90]和在蛋白水解消化過程中提高穩(wěn)定性[91]。
　　本研究旨在通過研究黑曲霉糖化酶的SBD結構域環(huán)化重排獲得不同N-末端后，插入環(huán)化重排SBD片段的重組菌株所表達的蛋白質與生淀粉結合性能的變化。另外研究在環(huán)化重排SBD片段的影響下，具有不同SBD結構域的黑曲霉糖化酶與生淀粉和普通淀粉親和性的變化及其酶活性的研究。
　　我們以黑曲霉基因組為模板，擴增得到黑曲霉GA的SBD結構域序列ANG-SBD和糖化酶全長序列A

4、NG。通過隨機環(huán)化重排獲得六種環(huán)化突變基因:ANGCP527、ANGCP546、ANGCP559、ANGCP585、ANGCP593和ANGCP605。六種環(huán)化突變基因和原始ANG-SBD基因插入質粒pet28a重組獲得原核表達體系，經表達純化后比較不同環(huán)化變換突變后的SBD的生淀粉結合性能的差異。同時為比較不同SBD突變對糖化酶生淀粉降解性能的影響，將全長序列ANG插入質粒pPIC9K重組獲得畢赤酵母真核表達體系，并用六個環(huán)化重排基因

5、替換ANG-SBD-pPIC9K重組質粒的原始SBD結構域序列，構建獲得六種整合型分泌表達淀粉酶的重組菌株:CP527，CP546，CP559，CP585，CP593和CP605。
　　結果表明:環(huán)化重排菌株CP546、CP559和CP593的生淀粉結合能力和水解比活相對于原始菌株都有較大程度的提高，其中CP546的生淀粉結合能力最強，其生淀粉結合能力是對照組的1.5倍，相對應的CP546純化后的純糖化酶液對生淀粉水解性能也最高為

6、5.59IU/mg，對照組是4.51IU/mg，水解比活大概提高20％。CP559和CP593對生淀粉結合能力分別提高27％和33％。而另外兩株環(huán)化重排菌株CP527，CP585的生淀粉結合能力和水解比活有較大程度的降低，CP605的生淀粉結合能力和生淀粉降解能力變化不大。而環(huán)化重排菌株的糖化酶可溶性淀粉水解比活相對于對照組變化不大，保持原來水平基本不變。
　　本課題研究結果表明，SBD結構域環(huán)化重排后，其生淀粉結合能力越高相對應