擬南芥隱花素蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、隱花素是植物的藍(lán)光受體，在植物中調(diào)節(jié)多種光形態(tài)建成，包括抑制下胚軸的伸長(zhǎng)、子葉的伸展和調(diào)節(jié)植物的開(kāi)花時(shí)間等，但隱花素依賴藍(lán)光調(diào)節(jié)光形態(tài)建成的分子機(jī)制仍然不清楚。本文以擬南芥隱花素突變體(CRY:cryl-304,crylcry2)和哥侖比亞野生型(col-4)幼苗為材料，采用蛋白質(zhì)雙向電泳分離技術(shù)、MALDI-TOF-TOF、離子阱質(zhì)譜鑒定技術(shù)以及生物信息學(xué)分析等手段，對(duì)在不同光處理?xiàng)l件下擬南芥隱花素突變體和野生型幼苗的全蛋白質(zhì)組和核蛋

2、白質(zhì)組進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，目的是探討擬南芥CRY、col-4光信號(hào)應(yīng)答相關(guān)蛋白質(zhì)，及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制。研究結(jié)果如下： (1)提取生長(zhǎng)在白光、藍(lán)光和暗處理中的cry1-304、col-4 7天幼苗的全蛋白質(zhì)，雙向電泳分離蛋白質(zhì)，經(jīng)圖像分析軟件分析，在cry1-304和col-4之間找到44個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，質(zhì)譜鑒定到21個(gè)蛋白質(zhì)。相對(duì)于cry1-304，在白光下有15個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)上調(diào)，6個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)下調(diào)：在藍(lán)光下有17個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)上調(diào)，

3、4個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)下調(diào)；暗處理中有7個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)上調(diào)，3個(gè)下調(diào)，9個(gè)不變，其余2個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)消失。這些蛋白質(zhì)中有兩個(gè)是未知功能的，其余的蛋白質(zhì)有7個(gè)參與代謝反應(yīng)并且其中是4個(gè)參與能量代謝、3個(gè)與抵抗壓力相關(guān)、4個(gè)參與轉(zhuǎn)錄、2個(gè)與蛋白質(zhì)合成有關(guān)、1個(gè)參與RNA合成、1個(gè)參與蛋白質(zhì)折疊、1個(gè)與細(xì)胞運(yùn)輸機(jī)制的功能相關(guān)。用半定量RT-PCR分析了其中4個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有1個(gè)蛋白質(zhì)水平的表達(dá)與相同處理下mRNA水平的表達(dá)相一致，另外3個(gè)

4、蛋白質(zhì)點(diǎn)的mRNA水平的表達(dá)與蛋白質(zhì)水平的表達(dá)不一致，其原因可能是由于基因表達(dá)存在翻譯后修飾。進(jìn)一步利用Matlab2006的K-means聚類程序的功能對(duì)21個(gè)差異蛋白質(zhì)的豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，依據(jù)野生型和突變體對(duì)光的反應(yīng)可分別形成6類不同反應(yīng)的蛋白表達(dá)方式。本實(shí)驗(yàn)為研究CRY1介導(dǎo)藍(lán)光調(diào)節(jié)基因表達(dá)提供了一個(gè)新的研究方法系統(tǒng)，這些分析結(jié)果表明光控制擬南芥的發(fā)育是通過(guò)共調(diào)節(jié)許多相關(guān)基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。 (2)采用雙向電泳技術(shù)分離

5、cry1cry2和col-4的7天幼苗的全蛋白質(zhì)，經(jīng)圖像軟件分析找到127個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，質(zhì)譜鑒定出75個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。在暗處理下，cry1cry2和野生型之間有67個(gè)蛋白質(zhì)豐度發(fā)生變化，cry1cry2有18個(gè)蛋白質(zhì)下調(diào)、49個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)上調(diào)；在藍(lán)光處理下，cry1cry2有44個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)下調(diào)，24個(gè)上調(diào)；在紅光處理下，有64個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的豐度發(fā)生改變，39個(gè)下調(diào)和25個(gè)上調(diào)；野生型coi-4用藍(lán)光或紅光處理，與暗處理比較，分別有40個(gè)和46

6、個(gè)蛋白點(diǎn)的豐度具有兩倍以上變化，而cry1cry2則分別有49個(gè)和40個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)豐度發(fā)生變化。數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果顯示，這些在不同光處理下差異表達(dá)的蛋白質(zhì)主要是參與碳水化合物代謝、能量代謝、細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成、抵抗壓力和抗氧化、蛋白質(zhì)的折疊和細(xì)胞壁的形成等功能而且亞細(xì)胞定位主要是在葉綠體和線粒體。我們的研究鑒定出了5個(gè)新的光反應(yīng)蛋白，分別是磷酸丙糖表異構(gòu)酶、甘油醛三磷酸脫氫酶A、果糖二磷酸醛縮酶、蘋(píng)果酸脫氫酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶B，這些蛋白質(zhì)在

7、cry1cry2藍(lán)光下的表達(dá)都減低。研究找到了7個(gè)與下胚軸生長(zhǎng)相關(guān)的蛋白，它們是榭皮酮3-0-甲基轉(zhuǎn)移酶、α木糖苷酶、枯草桿菌蛋白水解酶、甘氨酸脫氫酶、甘氨酸富于蛋白、甘氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶，并初步找到了一些與CRY功能相關(guān)的基因。進(jìn)一步對(duì)75個(gè)鑒定到的差異蛋白質(zhì)的豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示對(duì)不同光處理反應(yīng)蛋白，野生型和雙突變體都分為6類，野生型和雙突變體的總聚類可以分為9類，而野生型和突變體在藍(lán)光和紅光下表達(dá)有差異的蛋白質(zhì)其親緣關(guān)系都

8、較近。通過(guò)對(duì)突變體和野生型的聚類分析，我們首次論證了蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜可用于研究各種突變體在不同光照條件下光應(yīng)答之間的關(guān)系。 (3)研究發(fā)現(xiàn)除了cry1cry2在藍(lán)光下調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)外，在紅光下蛋白質(zhì)表達(dá)水平也有明顯的差異。為了進(jìn)一步檢測(cè)隱花素是否在藍(lán)光和紅光下都調(diào)節(jié)相關(guān)基因的mRNA的表達(dá)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)豐度的改變，我們用RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了野生型和cry1cry2幼苗生長(zhǎng)在暗、紅光和藍(lán)光下的CHS、CAB2、GDH和F

9、NR等4個(gè)基因的mRNA的表達(dá)。結(jié)果表明cry1cry2在紅光和藍(lán)光下都影響GDH和FNR的mRNA水平表達(dá)的變化，它們的變化趨勢(shì)與蛋白質(zhì)變化趨勢(shì)一樣，在野生型的藍(lán)光與暗處理的比較(B/D)或紅光與暗處理的比較(R/D)中都增加而在相同比較下突變體cry1cry2中是降低或沒(méi)變化。這些結(jié)果提示，隱花素除了本身特異的藍(lán)光功能外，還具有調(diào)節(jié)紅光受體光敏素從而調(diào)控基因表達(dá)的作用。 (4)用雙向電泳、MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜及離子

10、阱質(zhì)譜鑒定了col-4、cry1-304或cry1cry2核蛋白，發(fā)現(xiàn)3個(gè)細(xì)胞定位在細(xì)胞核的蛋白質(zhì)，其中14-3-3類蛋白質(zhì)(GF14)對(duì)比野生型在兩種突變體中表達(dá)都是上調(diào)，該蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)具有蛋白質(zhì)綁定的功能，定位于細(xì)胞核核膜，用熒光定位分析表明該蛋白質(zhì)表達(dá)在細(xì)胞核內(nèi)。這一結(jié)果為將來(lái)進(jìn)一步研究CRY在核內(nèi)的功能提供了有用的信息。 本研究進(jìn)一步證實(shí)，擬南芥CRY基因介導(dǎo)藍(lán)光可以引起一系列蛋白質(zhì)表達(dá)的改變。我們的結(jié)果還首次發(fā)現(xiàn)了隱花素