基于移動(dòng)反應(yīng)界面的聚丙烯酰胺凝膠電泳及其應(yīng)用研究.pdf

1、聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）作為一種經(jīng)典的分離分析技術(shù)，因?yàn)槠涑墒斓牟僮鳎芎玫姆蛛x效果，商業(yè)化的電泳裝置，已經(jīng)在生農(nóng)化醫(yī)等實(shí)驗(yàn)室被廣泛的應(yīng)用于蛋白質(zhì)、DNA、納米粒子等物質(zhì)的分離分析中。從19世紀(jì)60年代提出該方法以來(lái)，PAGE在其應(yīng)用范圍和方法的靈敏度提高方面得到了很大的發(fā)展，但仍然有兩點(diǎn)有待發(fā)展，一是PAGE分離的原理多是基于等速電泳的原理（不像毛細(xì)管電泳已經(jīng)

2、發(fā)展出超過(guò)十種分離模式）；二是經(jīng)典的PAGE上樣量一般不高于15μl，上樣量大則分辨率變差。近年來(lái)，移動(dòng)反應(yīng)界面（moving reaction boundary，MRB）理論發(fā)展很迅速，尤其是移動(dòng)中和界面（moving neutralization boundary，MNB）已用于化學(xué)分析中包括等電聚焦（isoelectric focusing，IEF）、酸堿滴定等基礎(chǔ)研究和兩性電解質(zhì)和小分子藥物的富集應(yīng)用研究。本文將移動(dòng)反應(yīng)界面的原

3、理應(yīng)用到PAGE中解決了存在的兩個(gè)問(wèn)題，以血紅蛋白為模式蛋白，對(duì)其成功的進(jìn)行了分離和富集，使靈敏度達(dá)到了至少8倍的提高。
　　本論文的綜述部分包括三個(gè)部分。1.聚丙烯酰胺凝膠電泳的基礎(chǔ)理論及其發(fā)展應(yīng)用。2.移動(dòng)反應(yīng)界面原理的發(fā)展，分類和應(yīng)用。3.血紅蛋白的種類和性質(zhì)，與臨床診斷相關(guān)的兩種蛋白的研究意義和常用的分析方法。實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分，首先是建立分離血紅蛋白的MRB-PAGE模型，然后是通過(guò)等電聚焦，MALDI-TOF MS對(duì)MR

4、B-PAGE分離得到的血紅蛋白條帶進(jìn)行鑒定。
　　在本課題的第一部分，我們根據(jù)已有的商業(yè)化的垂直電泳裝置構(gòu)建了MRB-PAGE分離大體積低豐度蛋白的理論模型，根據(jù)模型優(yōu)化了膠濃度，交聯(lián)度，三種關(guān)鍵緩沖液的濃度和pH值等參數(shù)。在第二部分中，使用優(yōu)化好的體系進(jìn)行了模式蛋白血紅蛋白的分離，與包括經(jīng)典 PAGE在內(nèi)的三種分離模式進(jìn)行了比較，靈敏度至少提高了8倍，并結(jié)合IEF，MS等技術(shù)對(duì)所分離的血紅蛋白條帶進(jìn)行了鑒定，得到了較為滿意的結(jié)果