九聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳測定蛋白質(zhì)的等電點

1、實驗九 聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳測定蛋白質(zhì)的等電點,,一、目的要求,1.學(xué)習(xí)和掌握圓盤電泳技術(shù)2.學(xué)習(xí)和掌握等電聚焦電泳測定蛋白質(zhì)的等電點方法,二、原理聚丙烯酰胺等電聚焦電泳(Isoelectric Focusing-PAGE，簡稱IEF-PAGE)：利用各種蛋白質(zhì)pI不同，以聚丙烯酰胺凝膠為電泳支持物，并在其中加入兩性電解質(zhì)載體(carrier ampholytes)，兩性電解質(zhì)載體在電場作用下，按各自pI形成從陽極到陰極逐

2、漸增加的平滑和連續(xù)的pH梯度。在電場作用下，蛋白質(zhì)在此pH梯度凝膠中泳動，當(dāng)遷移至pH值等于pI處時，就不再泳動，而被濃縮成狹窄的區(qū)帶。,兩性電解質(zhì)載體(carrier ampholytes)(1)易溶于水，在pI處應(yīng)有足夠的緩沖能力，形成穩(wěn)定的pH梯度，不致被蛋白質(zhì)或其它兩性電解質(zhì)改變pH梯度。(2)在pI處應(yīng)有良好的電導(dǎo)及相同的電導(dǎo)系數(shù)，以保持均勻的電場。(3)分子量小，可通過透析或分子篩法除去，便于與生物大分子分開。(4)

3、化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，也無變性作用，其化學(xué)組成不同于蛋白質(zhì)。,IEF-PAGE分離蛋白質(zhì)并測定pI,圖3.6聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖(A為正面,B為剖面)(1)樣品膠pH6.7 (2)濃縮膠pH6.7 (3)分離膠pH8.9 (4)電極緩沖液pH8.3,三、試劑與器材,試劑：兩性電解質(zhì)載體pH 3-10 、10%四甲基乙二胺 、10%過硫酸銨 、5%H3PO4 、2%NaOH 、40%蔗糖 、0.

4、04％考馬斯亮蘭R250 、7%醋酸器材：圓盤電泳槽 、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 、脫色搖床,四、操作方法1. 凝膠柱的制備（1）玻璃管的一端插在橡皮帽中(與橡皮接觸的部分凝膠不易聚合，可在橡皮帽中先加一滴40%的蔗糖)（2）配膠表 10mL 7.5%凝膠的配制試 劑 名 稱 體積(mL)凝膠貯液 2.5兩性電解質(zhì)載體 0.510%TEMED

5、 0.1蛋白質(zhì)混合樣品 0.1蒸餾水 6.75混勻后置真空干燥器中抽氣10 min10%過硫酸銨 0.05,,,,（3）將配好的凝膠溶液用細長頭滴管加到預(yù)先準備好的玻管中，至離上端1 cm處，再用注射器緩緩加水3-5 mm高。（4）待凝膠聚合2. 電泳小心地拔出玻管，并用蒸餾水洗去蔗糖溶液，把管固定到電泳槽上槽的洞中

6、（安裝時要保證凝膠管垂直且橡膠塞孔密封不漏）在上槽中加入5%磷酸緩沖液，在下槽中裝入2%氫氧化鈉溶液。避免管下有氣泡。上槽接電泳儀的正極，下槽接負極，打開電源，先調(diào)電壓至100 V，待電壓穩(wěn)定后再升到300 V，電泳2 h以上至電流降為0，將電壓調(diào)至0，關(guān)閉電源。,3．剝膠 電泳結(jié)束后，取下凝膠管，用蒸餾水充分洗凈兩端電極液，在凝膠條的正極端插一銅絲為標記。用灌滿水的注射器長針頭插入凝膠與玻管管壁之間，邊壓水邊慢慢轉(zhuǎn)動玻管，推針前

7、進，同時注入水，靠水流壓力和潤滑力將玻璃管內(nèi)壁與凝膠分開，凝膠條即可流出。 4 .固定染色取其中一條凝膠條放在一塊潔凈的玻板上，用尺量出固定前的凝膠條長度。放入染色液中同時進行固定染色1-2 h，用蒸餾水漂洗數(shù)次后用脫色液脫色，直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，量出蛋白帶距正極端的距離。,5. pH梯度的制作取另一條凝膠條放在玻板上，從凝膠的正極端開始，每隔0.5 cm切下一段，依次放入已編好號并裝有1 mL蒸餾水的試管中，浸泡過夜。次

8、日用酸度計分別測定每管浸提液的pH值。以凝膠長度為橫坐標，pH值為縱坐標，繪制標準pH梯度曲線。6 .蛋白質(zhì)樣品等電點的計算 求出蛋白質(zhì)聚焦部位距凝膠條正極端的實際長度為：固定后的蛋白區(qū)帶中心距凝膠條正極端的距離? 固定染色前凝膠條長度 固

9、定染色后凝膠條長度計算出蛋白質(zhì)聚焦部位距凝膠條正極端的實際長度后，直接從pH梯度曲線上求出該蛋白質(zhì)等電點。,,五、注意事項鹽離子可干擾pH梯度形成并使區(qū)帶扭曲。為防止上述影響，進行IEF-PAGE時，樣品應(yīng)透析或用SephadexG-25脫鹽，也可將樣品溶解在水或低鹽緩沖液中使其充分溶解，以免不溶小顆粒引起拖尾。加樣量則取決于樣品中蛋白質(zhì)的種類、數(shù)目以及檢測方法的靈敏度。如用考馬斯亮藍R-250染色，加樣量可為50-150 ?