蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測(cè)定

1、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測(cè)定及性質(zhì)實(shí)驗(yàn)及性質(zhì)實(shí)驗(yàn)一、目的：了解等電點(diǎn)的意義及其與蛋白質(zhì)分子聚沉能力的關(guān)系。初步學(xué)會(huì)測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的基本方法，了解蛋白質(zhì)的性質(zhì)。初步學(xué)會(huì)測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的基本方法，了解蛋白質(zhì)的性質(zhì)。二、原理：固體顆粒在液體中為什么能夠帶電？當(dāng)固體與液體接觸時(shí)，固體可以從溶液中選擇性吸附某種離子，也可以是固體分子本身發(fā)生電離作用而使離子進(jìn)入溶液，以致使固液兩相分別帶有不同符號(hào)的電荷，由于電中性的要求，帶電表面附近的液體

2、中必有與固體表面電荷數(shù)量相等但符號(hào)相反的多余的反離子。在界面上帶電表面和反離子形成了雙電層的結(jié)構(gòu)。在兩種不同物質(zhì)的界面上，正負(fù)電荷分別排列成的面層。對(duì)于雙電層的具體結(jié)構(gòu)，一百多年來不同學(xué)者提出了不同的看法。最早于1879年Helmholz提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chapman修正了平板型模型，提出了擴(kuò)散雙電層模型；后來Stern又提出了Stern模型。根據(jù)O.斯特恩的觀點(diǎn)，一部分反離子由于電性吸引或非電性的特性吸引

3、作用（例如范德華力）而和表面緊密結(jié)合，構(gòu)成吸附層（或稱緊密層、斯特恩層）。其余的離子則擴(kuò)散地分布在溶液中，構(gòu)成雙電層的擴(kuò)散層（或稱滑移面）。由于帶電表面的吸引作用，在擴(kuò)散層中反離子的濃度遠(yuǎn)大于同號(hào)離子。離表面越遠(yuǎn)，過剩的反離子越少，直至在溶液內(nèi)部反離子的濃度與同號(hào)離子相等。蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)量方式：溶解度最低時(shí)的溶液pH。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子在電場(chǎng)中不向任何一極移動(dòng)，而且分子與分子間因碰撞而引起聚沉的傾向增加，所以這時(shí)可以使蛋白質(zhì)溶液的

4、粘度、滲透壓均減到最低，且溶液變混濁。蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小，最容易沉淀析出。蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)都不相同，但偏酸性的較多，如牛乳中的酪蛋白的等電點(diǎn)是4.7~4.8，血紅蛋白等電點(diǎn)為6.7~6.8，胰島素是5.3~5.4，魚精蛋白是一個(gè)典型的堿性蛋白，其等電點(diǎn)在pH12.0~12.4。本實(shí)驗(yàn)采用蛋白質(zhì)在不同pH溶液中形成的混濁度來確定，即混濁度最大時(shí)的pH值即為該種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)值，這個(gè)方法雖然不很準(zhǔn)確，但在一般實(shí)驗(yàn)

5、條件下都能進(jìn)行，操作也簡(jiǎn)便。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)比較準(zhǔn)確的方法是采用等電聚焦技術(shù)加以準(zhǔn)確測(cè)定，但需一定的實(shí)驗(yàn)條件。等電聚焦等電聚焦電泳電泳（IEF，isoelectricfocusingelectrophesis）利用特殊的一種緩沖液（兩性電解質(zhì)）在凝膠（常用聚丙烯酰胺凝膠）內(nèi)制造一個(gè)pH梯度，電泳時(shí)每種蛋白質(zhì)就將遷移到等于其等電點(diǎn)（pI）的pH處（此時(shí)此蛋白質(zhì)不再帶有凈的正或負(fù)電荷），形成一個(gè)很窄的區(qū)帶。IEF的基本原理的基本原理在IEF的

6、電泳中，具有pH梯度的介質(zhì)其分布是從陽極到陰極，pH值逐漸增大。如前所述，蛋白質(zhì)分子具有兩性解離及等電點(diǎn)的特征，這樣在堿性區(qū)域蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷向陽極移動(dòng)，直至某一pH位點(diǎn)時(shí)失去電荷而停止移動(dòng)，此處介質(zhì)的pH恰好等于聚焦蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)（pl）。同理，位于酸性區(qū)域的蛋白質(zhì)分子帶正電荷向陰極移動(dòng)，直到它們的等電點(diǎn)上聚焦為止?？梢娫谠摲椒ㄖ?，等電點(diǎn)是蛋白質(zhì)組分的特性量度，將等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)混合物加入有pH梯度的凝膠介質(zhì)中，在電場(chǎng)內(nèi)經(jīng)過一

7、定時(shí)間后，各組分將分別聚焦在各自等電點(diǎn)相應(yīng)的pH位置上，形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶。沉淀反應(yīng)：蛋白質(zhì)在某種理化條件下，蛋白膠體溶液的水化層或者電荷層破壞，蛋白膠體相互聚集的現(xiàn)象。主要的沉淀現(xiàn)象有（1）鹽析：在蛋白質(zhì)水溶液中加入足量的鹽類（如硫酸銨），可析出沉淀，稀釋后能溶解并仍保持原來的性質(zhì)，不影響蛋白質(zhì)的活性。這是一個(gè)可逆的過程，可用于蛋白質(zhì)的分離與初級(jí)提純。（2）變性：在重金屬鹽、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、加熱、紫外線等作用下，引起蛋白質(zhì)某些理性質(zhì)改變