小鼠胚胎干細(xì)胞系的建立與體外誘導(dǎo)向生殖細(xì)胞分化研究.pdf

1、小鼠胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcells）是由囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)在體外培養(yǎng)條件下建立的多能性干細(xì)胞系，具有形成嵌合體的能力，并能發(fā)育為嵌合體的任何組織、細(xì)胞類型，包括生殖細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞在體外也能自發(fā)分化形成三個(gè)胚層的細(xì)胞;在特定誘導(dǎo)條件下，能分化成肌肉、神經(jīng)、胰島等細(xì)胞類型。特別地，胚胎干細(xì)胞在一定條件的誘導(dǎo)下，可以體外向生殖細(xì)胞分化。
　　生殖系的發(fā)育是大多數(shù)物種全能性（受精卵）和子代產(chǎn)生的源頭。在小鼠中，生殖系發(fā)育起始

2、于原生殖細(xì)胞(primodialgermcells)在胚胎發(fā)育第7天的出現(xiàn);而這一過程受到了精密的細(xì)胞信號(hào)調(diào)控，特別是BMP4/Smads和SCF/c-Kit信號(hào)通路，前者對(duì)于原生殖細(xì)胞發(fā)育、后者對(duì)于原生殖細(xì)胞生長(zhǎng)是必須的。無論雌雄，原生殖細(xì)胞都是最終的生殖細(xì)胞——卵母細(xì)胞和精子——的來源。在雄性小鼠，原生殖細(xì)胞在特化后遷移到發(fā)育中的雄性生殖脊，最終形成精原干細(xì)胞(spermatogonialstemcells)，通過減數(shù)分裂維持整個(gè)雄

3、性小鼠成年后的生精過程。
　　本研究擬利用細(xì)胞因子誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞在體外條件下向生殖脊分化。首先，C57BL/6J雌鼠與Oct4-EGFP轉(zhuǎn)基因雄鼠（ES-4N）交配后，分離其囊胚，建立胚胎干細(xì)胞系。不同的培養(yǎng)條件下，小鼠胚胎干細(xì)胞建系的效率明顯不同，在2i-LIF培養(yǎng)基中效率最高，且干細(xì)胞維持基態(tài)(groundstate)。
　　為了使得胚胎干細(xì)胞在最終分化為精子后便于分離、觀察、鑒定，對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞進(jìn)行了精子特異性熒

4、光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)。利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了pAcr-DsRed重組載體。載體啟動(dòng)子為頂體素基因(Acr)的啟動(dòng)子，其在減數(shù)分裂以后的精子細(xì)胞中開始表達(dá)，因此可以用來特異性標(biāo)記精子。將重組載體電轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞，經(jīng)G418篩選出陽(yáng)性克隆后，制備嵌合體小鼠。
　　利用細(xì)胞因子對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化。首先利用bFGF和ActivinA誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向表胚層細(xì)胞(epiblast)分化;再用BMP4和SCF誘導(dǎo)其向生殖細(xì)胞分化。實(shí)驗(yàn)結(jié)

5、果顯示，在BMP4和SCF的作用下，胚胎干細(xì)胞向生殖系分化，相關(guān)特異性蛋白在誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)錄水平明顯上升。BMP4單獨(dú)作用也可得到類似的結(jié)果，而SCF單獨(dú)作用不能誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向生殖系分化。這與生殖系在體內(nèi)發(fā)育時(shí)的信號(hào)調(diào)控通路是一致的。
　　綜上所述，小鼠胚胎干細(xì)胞在體外建系時(shí)，2i-LIF培養(yǎng)體系是最為高效的;在轉(zhuǎn)染了精子特異性標(biāo)記后，胚胎干細(xì)胞仍具有全能性，這為研究胚胎干細(xì)胞向生殖系發(fā)育提供了很好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)表明，