染矽塵大鼠肺泡上皮細胞誘導骨髓間充質干細胞分化的研究.pdf

1、目的：觀察與染矽塵大鼠肺泡上皮細胞（AEC）共培養(yǎng)能否誘導骨髓間充質干細胞( BMMSCs)分化為AEC。
　　方法:1、隨機取6只無特定病原體(SPF)級健康雄性SD大鼠，采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)BMMSCs。2、隨機取同批大鼠14只，其中7只以1.0 mL質量濃度為40 g/L的矽塵混液氣管內注入制作染矽塵大鼠模型，用免疫粘附純化法培養(yǎng)染矽塵大鼠AEC，另7只注入0.9％氯化鈉溶液1.0 mL作為正常對照大鼠，采用免疫粘附純化

2、法培養(yǎng)正常大鼠AEC。3、設置實驗組：以BMMSCs與染矽塵大鼠AEC兩種細胞共培養(yǎng)作為實驗組，對照A組：以BMMSCs和正常大鼠AEC兩種細胞共培養(yǎng)作為對照A組，對照B組：以BMMSCs單獨培養(yǎng)作為對照B組。4、分別于共培養(yǎng)第4天和第8天時，以倒置熒光顯微鏡（IFM）觀察各組BMMSCs的形態(tài)變化。5、分別于共培養(yǎng)第4天和第8天時，對各組BMMSCs進行水通道蛋白5（AQP5）和表面活性蛋白C（SP-C）免疫熒光雙重染色，分別用IFM

3、和激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）觀察BMMSCs的熒光表達情況，采用Image-pro plus6.0圖像分析軟件對兩種顯微鏡下2種蛋白的熒光進行積分光密度（IOD）分析。6、分別于共培養(yǎng)第4天和第8天時，采用實時熒光定量PCR檢測各組BMMSCs中AQP5和SP-C兩種信使RNA(mRNA）的表達水平。7、分別于共培養(yǎng)第4天和第8天，采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測培養(yǎng)液中轉化生長因子β1（TGFβ1）和表皮生長因子（EGF）的濃度

4、。
　　結果：1、各組細胞形態(tài)觀察顯示，共培養(yǎng)后，實驗組和對照A組的BMMSCs逐漸從長梭形向立方形和多邊形轉化，共培養(yǎng)第8天時細胞形態(tài)變化較第4天更明顯，但對照A組BMMSCs在兩個時間點形態(tài)變化無實驗組明顯，對照B組BMMSCs的形態(tài)在兩個時間點無明顯變化。2、IFM和LSCM觀察顯示：在共培養(yǎng)第4天和第8天，實驗組和對照A組BMMSCs均可見呈綠色熒光的AQP5和紅色熒光的SP-C表達，對照B組BMMSCs在兩個時間點均可見

5、少量AQP5綠色熒光表達，均無SP-C紅色熒光表達，相較于IFM，LSCM可清晰地觀察不同蛋白的表達及其在細胞內的分布情況。3、IOD分析顯示：在共培養(yǎng)第4天和第8天，IFM和LSCM所得BMMSCs的2種蛋白熒光IOD值在實驗組均較同時間點對照A組和對照B組增強（P＜0.01），而對照A組BMMSCs的2種蛋白熒光IOD值又均較相同時間點對照B組增強（P＜0.01）；在不同時間點之間進行比較，實驗組和對照A組的BMMSCs在第8天時2

6、種蛋白的熒光IOD值均較同組第4天時增強（P＜0.01）。將兩種顯微鏡所得IOD進行比較,除對照B組的SP-C蛋白熒光IOD外，IFM所得3組BMMSCs的2種蛋白熒光IOD均高于同組LSCM所得（P＜0.01）。4、實時熒光定量PCR結果顯示：相同時間點實驗組AQP5和SP-C mRNA表達水平較對照A組和對照B組均高（P＜0.01），對照A組較對照B組高（P＜0.01）；實驗組和對照A組在共培養(yǎng)第8天時mRNA表達量均較第4天高（P

7、＜0.01）。5、TGFβ1和EGF濃度檢測顯示：在相同時間點實驗組細胞培養(yǎng)液中TGF-β1濃度較對照A組和對照B組均低（P＜0.01）， EGF濃度較對照A組和對照B組均高（P＜0.01），對照A組細胞培養(yǎng)液中TGF-β1濃度較對照B組低（P＜0.01），EGF濃度較對照B組高（P＜0.01）；相同組別兩時間點間比較，TGF-β1濃度均無統(tǒng)計學意義（P>0.01），EGF濃度實驗組和對照A組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。