陰道上皮細胞體外誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向上皮細胞分化的研究.pdf

1、第一部分:大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　 目的:建立一套簡單高效，重復性好的體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)的方法，為陰道組織工程的研究作準備。
　　 方法:全骨髓貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)MSCs。分離大鼠雙側(cè)脛、股骨，剪去兩側(cè)骨骺端，無菌條件下用DMEM/F12培養(yǎng)基沖洗骨髓腔。獲得的細胞懸液移入離心管2009，5min離心。棄上清，DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸，70μm細胞篩過濾細胞懸液，計數(shù)，調(diào)整

2、細胞濃度為7.5×107/ml，以1.5×107個/cm2密度鋪于25cm2細胞培養(yǎng)瓶中，即每瓶5ml。置細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48小時首次半量換液，之后3-4天換液一次。待細胞70％-80％融合時使用胰蛋白酶消化傳代。棄去培養(yǎng)液，37℃預熱的PBS液沖洗約2-3次，加入0.5ml胰蛋白酶溶液，25℃消化約2min，加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化。彎頭吸管沿瓶底輕輕吹打，收集細胞懸液，以1×104個/cm2的密度接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)進

3、行擴增培養(yǎng)。MTT法評價第1至5代細胞增殖情況。經(jīng)傳代純化后第三至五代MSCs使用流式細胞學分析CD29，CD90及CD45表達。成骨成脂誘導鑒定MSCs的多向分化能力。成骨誘導液誘導14天后，按照試劑盒說明做堿性磷酸酶(ALP)活力測定，不溶的紅色顆粒沉淀指示ALP的活性位點。誘導21-28天時，用茜素紅染色評價大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的礦化能力。成脂誘導液誘導14天后油紅O染色確定是否有脂滴生成。
　　 結(jié)果:原代培養(yǎng)7-10天

4、左右細胞呈集落生長，逐漸融合成片，融合約70％-80％，可傳代培養(yǎng)。傳代活細胞24 h完全貼壁生長。傳代后細胞生長更快，三至五天后細胞即可融合，呈梭形漩渦樣生長，可再次傳代。傳代MSCs在接種第1-2天為細胞適應期，第3-4天進入對數(shù)生長期。第5天后曲線逐漸變得平緩，細胞增殖明顯減慢，進入平臺期。MSCs經(jīng)流式細胞分析高表達CD29，CD90，陽性率分別為99.91％、99.95％;而CD45呈陰性，陽性率為0.03％。成骨分化誘導2周

5、后ALP活性增高，4周后茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色陽性。成脂分化誘導2周后細胞中出現(xiàn)油紅O染色陽性的脂滴。
　　 結(jié)論:使用全骨髓貼壁培養(yǎng)法可以獲得高純度，具有多向分化能力的MSCs。
　　 第二部分:大鼠陰道上皮細胞原代培養(yǎng)方法的改進
　　 目的:探討大鼠陰道上皮細胞(VECs)體外培養(yǎng)的影響因素，對現(xiàn)有的VECs體外分離培養(yǎng)方法進行改進，建立大鼠陰道上皮細胞穩(wěn)定的體外分離培養(yǎng)方法以用于組織工程。
　　 方法:

6、酶消化法分離消化大鼠陰道上皮細胞。取陰道全層組織，修剪成1×0.5cm大小，移入超凈臺。組織塊經(jīng)4℃PBS清洗液徹底清洗6遍，加入中性蛋白酶Ⅱ型(DispaseⅡ)，放4℃冰箱過夜消化18h。取出后經(jīng)PBS沖洗，分離上皮層。上皮層加入0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA后37℃消化。輕輕吹打，DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化，吸管吹打成單細胞懸液，2009，5min離心，KBM完全培養(yǎng)液重懸，細胞計數(shù)板計活細胞數(shù)量，細胞懸液以1.0

7、×105個/cm2的密度接種于培養(yǎng)板中，置細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。第2天首次換液，以后每兩天換液一次。在此方法基礎(chǔ)上比較大鼠不同動情周期（動情前期，動情期，動情后期），不同DispaseⅡ配置（PBS配置與KBM配制），不同DispaseⅡ濃度（0.6U/ml與1.2U/ml），不同胰蛋白酶消化方法（30min消化一次與10min重復3次），培養(yǎng)表面不同處理（FN/C包被及去離子水包被），不同培養(yǎng)基（KBM培養(yǎng)基與含6％FBS的KBM培養(yǎng)

8、基）對大鼠陰道上皮細胞體外培養(yǎng)的影響，對上皮分離的結(jié)果進行評分，并觀察48h首次換液時細胞貼壁情況。免疫細胞化學染色及免疫熒光檢測廣譜角蛋白AE1/AE3表達。掃描電鏡觀察細胞表面超微結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果:動情前期的大鼠陰道上皮層消化后可獲得更多大鼠陰道上皮細胞（P=0.0346）;上皮層用KBM配制的DispaseⅡ消化后48h貼壁細胞多于用PBS配制的DispaseⅡ;1.2U/mlDispaseⅡ的分離結(jié)果評分及可獲活細胞數(shù)

9、高于0.6U/mlDispaseⅡ（P=0.025; P=0.034）;三步胰酶消化方法相比一步胰酶消化方法可獲得更多的貼壁細胞;FN/C包被液處理的培養(yǎng)表面相比去離子水可以獲得更多的貼壁細胞;大鼠陰道上皮細胞在含血清培養(yǎng)基中生長快，但易受成纖維細胞污染。經(jīng)改良方法培養(yǎng)的VECs免疫細胞化學染色及免疫熒光顯示廣譜角蛋白AE1/AE3陽性。掃描電鏡顯示VECs呈鑲嵌排列，細胞之間界限清晰，表面可見褶曲和微絨毛，呈不規(guī)則疏網(wǎng)狀。
　　

10、 結(jié)論:使用改良的原代培養(yǎng)方法可獲得更多的大鼠陰道上皮細胞，細胞顯示上皮細胞特征。
　　 第三部分:大鼠陰道上皮細胞誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向上皮細胞的分化
　　 目的:探索體外誘導骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)向上皮細胞分化的可行性。
　　 方法:將陰道上皮細胞(VECs)鋪于事先包被FN/C的0.4μm Transwellinsert共培養(yǎng)小室內(nèi)，與鋪有MSCs的6孔板建立間接共培養(yǎng)體系，誘導MSCs向上皮細胞分

11、化。分別于0天、7天及14天時，移去小室，倒置顯微鏡下觀察MSCs的形態(tài)變化。細胞爬片使用免疫細胞化學染色對誘導后的MSCs進行上皮細胞標志物廣譜角蛋白AE1/AE3的檢測。VECs和MSCs分別用作陽性及陰性對照。Western Blot檢測上皮細胞標志物廣譜角蛋白AE1/AE3的表達水平。GAPDH用作內(nèi)參照物。
　　 結(jié)果:MSCs與VECs共培養(yǎng)誘導分化7天時，MSCs的形態(tài)由0天時長梭形開始變?yōu)樯掀拥亩噙呅?。共培養(yǎng)1

12、4天時，更多MSCs變?yōu)槎噙呅巍Ｃ庖呒毎瘜W染色表明經(jīng)誘導7天及14天的MSCs廣譜角蛋白AE1/AE3表達陽性;Western blot檢測誘導后的MSCs表達AE1/AE3，誘導7天組AE1/AE3的蛋白水平高于0天組(36.28±1.49 vs.1.00±0.00，P＜0.01)，誘導14天組AE1/AE3的蛋白水平高于0天組(48.80±3.17 vs.1.00±0.00,P＜0.01)及7天組（48.80±3.17 vs.36

13、.28±1.49,P=0.0232）。
　　 結(jié)論:VECs可以通過間接共培養(yǎng)的方式誘導MSCs向上皮細胞分化，上皮細胞標志物廣譜角蛋白AE1/AE3的表達量隨時間延長而增高。
　　 第四部分:骨髓間充質(zhì)干細胞向上皮細胞分化中Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控作用
　　 目的:探討骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)向上皮細胞分化過程中Wnt/β-catenin信號通路的可能作用。
　　 方法: MSCs和

14、VECs間接共培養(yǎng)誘導分化。分別于0天、7天及14天時，使用Western Blot對誘導后的MSCs及VECs進行Wnt/β-catenin信號通路的重要成分β-catenin，GSK-3β，pi-GSK-3β，TCF-3表達水平的測定。為研究Wnt信號通路在MSCs向上皮細胞分化中的調(diào)控作用，分三組進行MSCs和VECs的間接共培養(yǎng)誘導:
　　 (1)對照組加入含3％FBS的KBM培養(yǎng)液;
　　 (2) Wnt通路激

15、動劑組加入含20μM氯化鋰(LiCl)的3％FBS-KBM培養(yǎng)液;
　　 (3) Wnt通路抑制劑組加入含20ng/ml Dickkopf-1（DKK-1）的3％FBS-KBM培養(yǎng)液。
　　 于共培養(yǎng)第7天移去培養(yǎng)小室，使用Western Blot對誘導后的MSCs進行Wnt/β-catenin信號通路的重要成分β-catenin，GSK-3β，TCF-3及廣譜角蛋白AE1/AE3的表達水平測定。GAPDH用作內(nèi)參照物。

16、
　　 結(jié)果:MSCs與VECs共培養(yǎng)7天時，Western blot檢測誘導后的MSCs其β-catenin(1.50±0.11 vs.1.00±0.00, P=0.009), pi-GSK-3β(1.50±0.23vs.1.00±0.00，P=0.09)及TCF-3(1.25±0.16 vs.1.00±0.00，P=0.19)的表達量逐漸增加，GSK-3β的表達量(0.69±0.04 vs.1.00±0.00，P=0.002

17、)逐漸減少。共培養(yǎng)14天與共培養(yǎng)7天相比，β-catenin(1.85±0.23 vs.1.50±0.11，P=0.24)與pi-GSK-3β(2.31±0.33 vs1.50±0.23，P=0.114)的表達水平增高，GSK-3β(0.34±0.03 vs.0.69±0.04, P=0.0021)及TCF-3(0.98±0.17 vs.1.25±0.16，P=0.3144)的表達水平下降。GSK-3β的表達與β-catenin呈現(xiàn)出相

18、反的趨勢。pi-GSK-3β的表達與GSK-3β也呈現(xiàn)出相反的趨勢。誘導7天時，20μM LiCl組β-catenin(1.24±0.07 vs.1.00±0.00,P=0.02),TCF-3(2.15±0.24 vs.1.00±0.00，P=0.14)表達增加，GSK-3β(0.60±0.07 vs.1.00±0.00，P＜0.01)表達減少;20ng/ml DKK-1組β-catenin(0.92±0.08 vs.1.00±0.00

19、，P=0.38)，TCF-3(0.77±0.09 vs.1.00±0.00，P=0.06)表達減少，GSK-3β(1.11±0.03 vs.1.00±0.00，P=0.02)表達增加。檢測AE1/AE3的表達水平發(fā)現(xiàn)相比對照組，LiCl可以增加AE1/AE3的表達水平(1.20±0.18 vs.1.00±0.00，P=0.32)，而DKK-1則降低AE1/AE3的表達(0.83±0.11 vs.1.00±0.00，P=0.19)。