腎康注射液抑制高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞應(yīng)激性衰老.pdf

1、目的：
　　糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的主要原因。腎小管間質(zhì)在DN進展中扮演了重要角色，近端腎小管上皮細(xì)胞作為最易受損的腎實質(zhì)細(xì)胞，在葡萄糖代謝紊亂環(huán)境中極易發(fā)生缺氧，氧化應(yīng)激損傷，表現(xiàn)為先增生后肥大繼而應(yīng)激性衰老。近期大量研究表明，DN早期患者腎組織中便出現(xiàn)衰老腎小管上皮細(xì)胞，同時在糖尿病早期大鼠模型腎組織中也有大量衰老腎小管上皮細(xì)胞，體外實驗亦證實高糖可加速腎小管上皮細(xì)胞

2、應(yīng)激性衰老，說明腎小管上皮細(xì)胞應(yīng)激性衰老是DN腎小管間質(zhì)損傷早期的重要細(xì)胞生物學(xué)事件。研究發(fā)現(xiàn)衰老的腎小管上皮細(xì)胞與腎小管萎縮，腎間質(zhì)炎癥，腎間質(zhì)纖維化，及腎功能密切相關(guān)，并且衰老的腎小管上皮細(xì)胞可增加腎臟對損傷刺激的易感性，抑制正常細(xì)胞增殖從而阻止受損腎臟的修復(fù)。因此腎小管上皮細(xì)胞應(yīng)激性衰老在DN進展中扮演了重要角色，防治腎小管上皮細(xì)胞應(yīng)激性衰老可能是延緩DN進展的一個新策略。
　　經(jīng)典方藥腎康注射液是由黃芪、大黃、丹參和紅花四

3、種中藥組成的復(fù)方制劑。腎康注射液(國藥準(zhǔn)字Z20040110)，于1999年經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)(YBZ08522004)用于治療慢性腎臟病。經(jīng)過大量臨床試驗研究，發(fā)現(xiàn)腎康注射液可明顯降低CKD患者的血肌酐，尿素氮水平，保護殘余腎功能，具有良好的有效性，安全性和遠期療效。體內(nèi)外研究均發(fā)現(xiàn)腎康注射液可以顯著抑制腎臟氧化應(yīng)激損傷，抑制腎間質(zhì)纖維化。已有體外研究證明腎康注射液能夠顯著抑制高糖誘導(dǎo)后系膜細(xì)胞肥大和P21表達等衰老細(xì)胞特征

4、樣改變，提示腎康注射液具有抑制高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞衰老的作用。因此，我們的研究關(guān)注腎康注射液是否具有抑制高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞衰老的作用及機制。
　　方法：
　　1.原代腎小管上皮細(xì)胞提取及鑒定
　　1.1取3周齡雄性C57小鼠斷頸處死，無菌獲取雙腎，去除腎包膜和腎蒂組織，加入Ⅱ型膠原酶37°消化30min，通過雙重過濾(依次通過250uM和80uM篩網(wǎng))，置入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
　　1.2利用免疫熒光

5、技術(shù)檢測細(xì)胞CK-18和villin的表達鑒定腎小管上皮細(xì)胞的純度。
　　2.建立高糖刺激腎小管上皮細(xì)胞衰老模型
　　高糖(30mmol/L)刺激第二代腎小管上皮細(xì)胞72h后(設(shè)等滲透壓甘露醇對照組、正常糖濃度對照組)后，觀察細(xì)胞形態(tài)及免疫熒光染色P16、DcR2和SA-β-Gal觀察細(xì)胞衰老情況。
　　3.明確腎康注射液能否抑制高糖刺激后腎小管上皮細(xì)胞衰老
　　實驗分組:①正常對照組;②30mmol/L高糖組;

6、③等滲透壓甘露醇組;④30mmol/L高糖+50mg/L腎康注射液;⑤30mmol/L高糖+100mg/L腎康注射液;⑥30mmol/L高糖+200mg/L腎康注射液;⑦5mmol/L正常糖+200mg/L腎康注射液。
　　腎康注射液和高糖培養(yǎng)腎小管細(xì)胞72h后，觀察細(xì)胞形態(tài)及免疫熒光染色檢測各組衰老指標(biāo):SAHF、p16、cyclinD1、DcR2和SA-β-Gal表達情況。
　　4.探明腎康注射液抑制高糖刺激后腎小管上皮

7、細(xì)胞衰老的機制
　　實驗分組:①正常對照組;②30mmol/L高糖組;③等滲透壓甘露醇組;④30mmol/L高糖+200mg/L腎康注射液;⑤5mmol/L正常糖+200mg/L腎康注射液;
　　腎康注射液和高糖培養(yǎng)腎小管細(xì)胞72h后，利用試劑盒檢測各組MDA含量和SOD活性。利用PCR、western blot檢測各組Klotho、Sirt1、PPAR-γ、p66Shc以及mTOR的表達水平。
　　5.統(tǒng)計學(xué)分析

8、r>　　采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，對于符合正態(tài)分布的組間比較進行單因素方差分析(ANOVA)，結(jié)果以P＜0.05為相差顯著。
　　結(jié)果：
　　1.高糖組腎小管上皮細(xì)胞明顯扁平肥大，衰老標(biāo)志p16Ink4，SAHF，cyclinD1，DcR2和SA-β-Gal明顯上調(diào)，甘露醇作為等滲對照組并未引起腎小管上皮細(xì)胞衰老。而腎康注射液可以顯著下調(diào)衰老標(biāo)志p16Ink4，SAHF，cy

9、clinD1，DcR2和SA-β-Gal的表達，使細(xì)胞形態(tài)趨于正常，具有良好的量效關(guān)系。腎康注射液可以顯著緩解高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞衰老指標(biāo)的表達，說明腎康注射液可以抑制高糖誘導(dǎo)后腎小管上皮細(xì)胞的衰老，呈現(xiàn)良好的劑量依耐性。
　　2.高糖組腎小管細(xì)胞MDA含量明顯上調(diào)而SOD活力明顯下降，而腎康注射液可以顯著下調(diào)MDA含量明顯上調(diào)SOD活力，提示腎康注射液具有抗氧化應(yīng)激的作用。
　　3.高糖組腎小管細(xì)胞mTOR和P66shc

10、促衰老分子表達上調(diào)， Klotho，Sirt1，PPAR-γ抗衰老分子表達下調(diào)，而腎康注射液可以顯著下調(diào)mTOR和P66shc促衰老分子，顯著增加Klotho，Sirt1，PPAR-γ抗衰老分子表達。腎康注射液通過抑制p66Shc、mTOR的表達，上調(diào)Klotho、Sirt1、PPAR-γ的表達抑制高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的衰老。
　　結(jié)論：
　　本研究證明了腎康注射液具有抑制高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞應(yīng)激性衰老的作用，這一作用可