細(xì)胞自噬調(diào)控對兔iPSCs形成及相關(guān)基因表達(dá)的影響初步研究.pdf

1、異位表達(dá)多能性因子誘導(dǎo)產(chǎn)生多能干細(xì)胞(induced pluripotent stemcells，iPSCs)技術(shù)為體細(xì)胞重編程研究開辟了一條新的途徑，不僅可避免倫理爭議，還為干細(xì)胞及再生醫(yī)學(xué)研究提供了新的研究方法。此外，iPSCs技術(shù)也是研究基因表達(dá)調(diào)控、蛋白質(zhì)相互作用、機(jī)體生長發(fā)育的重要手段。目前，有關(guān)人的iPSCs研究已經(jīng)取得許多進(jìn)展，但對體細(xì)胞重編程機(jī)理尚不完全了解，離應(yīng)用還有一定距離，仍需利用動(dòng)物模型進(jìn)行更深入的研究。兔的iP

2、SCs在形態(tài)上與人iPSCs類似，這使得兔iPSCs相關(guān)研究成為關(guān)注的熱點(diǎn)。本研究采用四環(huán)素(Doxycycline，DOX)誘導(dǎo)型的慢病毒載體攜帶Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc4個(gè)多能性轉(zhuǎn)錄因子，將仔兔皮膚成纖維細(xì)胞(REFs)重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(RiPSCs)，并對內(nèi)源多能性因子表達(dá)及細(xì)胞多能性進(jìn)行分析，并利用雷帕霉素(Rapamycin)調(diào)控細(xì)胞自噬，觀察其對誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程效率及相關(guān)基因表達(dá)的影響，以便為提高RiP

3、SCs重編程效率、改善RiPSCs細(xì)胞狀態(tài)奠定基礎(chǔ)。
　　1、兔iPSCs的誘導(dǎo):通過慢病毒感染方法，將攜帶Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的病毒轉(zhuǎn)入REFs并加入DOX誘導(dǎo)其表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)2天后，細(xì)胞形態(tài)開始出現(xiàn)變化，一周后形成克隆。RiPSCs克隆邊緣整齊、折光性強(qiáng)、與周圍細(xì)胞界限明顯，細(xì)胞排列緊密、核質(zhì)比增加。形成的RiPSCs克隆堿性磷酸酶(AP)檢測結(jié)果為陽性;RT-PCR結(jié)果顯示其表達(dá)內(nèi)源性的

4、Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog基因;細(xì)胞免疫熒光檢測結(jié)果表明，形成的RiPSCs克隆表達(dá)Oct4、Sox2、Stat3、Ssea1，未檢測到E-cadherin表達(dá)。挑取了約150株克隆進(jìn)行傳代培養(yǎng)，有6株可傳至20代以上并保持原有的克隆形態(tài)及多能性。
　　2、細(xì)胞自噬調(diào)控對iPSCs誘導(dǎo)過程中相關(guān)基因表達(dá)及iPSCs形成的影響。探討了不同濃度雷帕霉素處理對REFs誘導(dǎo)過程中自噬相關(guān)基因表達(dá)及RiPSCs形成

5、的影響。誘導(dǎo)前3天添加不同濃度的雷帕霉素，待克隆形成后統(tǒng)計(jì)堿性磷酸酶(AP)陽性克隆數(shù)并觀察克隆形態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素處理的較適濃度為0.5nmol·L-1。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，0.5nmol·L-1雷帕霉素處理后，除了ATG5在整個(gè)誘導(dǎo)過程中穩(wěn)定表達(dá)之外，其余3個(gè)自噬相關(guān)基因ATG7、LC3、ULK1的表達(dá)水平在誘導(dǎo)過程中均有提高（P＜0.05），但升高的程度及表達(dá)時(shí)間有所不同;Oct4、Sox2、K1f4多能性基因的表達(dá)水