宿主細(xì)胞自噬對(duì)微小隱孢子蟲入侵影響的初步研究.pdf

1、自噬是細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)的一種機(jī)制，自上世紀(jì)50年代由比利時(shí)科學(xué)家Christian首次發(fā)現(xiàn)后，愈發(fā)引起眾多學(xué)者的關(guān)注。自噬是細(xì)胞內(nèi)自噬小體與溶酶體結(jié)合降解自身細(xì)胞器和其他大分子的過(guò)程，它除了可以維持細(xì)胞內(nèi)成分更新外，還可以選擇性識(shí)別并清除入侵的病原微生物，在細(xì)胞與病原體相互作用的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。寄生蟲是除細(xì)菌、病毒之外的一類重要病原體，蟲體刺激宿主細(xì)胞，在誘導(dǎo)和逃避宿主免疫反應(yīng)之間保持一種平衡，而宿主細(xì)胞也在感染和消除感染之間保持一

2、種平衡。目前，細(xì)胞自噬與寄生蟲感染相互作用的研究多集中在危害較為嚴(yán)重的胞內(nèi)寄生蟲如頂復(fù)門孢子綱的弓形蟲、瘧原蟲和肉足鞭毛綱的錐蟲上。對(duì)于隱孢子蟲與宿主自噬之間的相互作用研究尚屬空白。
　　本研究圍繞隱孢子蟲入侵宿主細(xì)胞這一環(huán)節(jié)，利用微小隱孢子蟲HCT-8細(xì)胞培養(yǎng)模型，初步探討了蟲體感染對(duì)宿主細(xì)胞自噬之間的相互作用關(guān)系。首先通過(guò)犢牛傳代，卵囊收集、純化、鑒定獲得微小隱孢子蟲卵囊用于體外感染實(shí)驗(yàn)。通過(guò)對(duì)不同培養(yǎng)基種類、血清濃度摸索，確

3、定1640培養(yǎng)基，10％FBS條件為體外感染實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)培養(yǎng)條件。通過(guò)HE染色和DAPI染色觀察微小隱孢子蟲在HCT-8細(xì)胞上的發(fā)育特性，摸清其發(fā)育階段的各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，結(jié)合參考文獻(xiàn)以及我們具體的實(shí)驗(yàn)條件，確定感染后3h，8h，18h作為評(píng)價(jià)其入侵率的時(shí)間節(jié)點(diǎn)。在優(yōu)化好的隱孢子蟲HCT-8宿主細(xì)胞體外培養(yǎng)模型基礎(chǔ)上，分別利用透射電鏡、免疫熒光、免疫印跡技術(shù)探討了微小隱孢子蟲感染對(duì)宿主細(xì)胞HCT-8自噬的激發(fā)作用。研究結(jié)果表明，微小隱孢子蟲感

4、染后宿主細(xì)胞的自噬泡數(shù)目增多，HCT-8細(xì)胞LC3Ⅱ蛋白表達(dá)量增高，HCT-8細(xì)胞的自噬水平提高。繼而建立并優(yōu)化了藥物對(duì)細(xì)胞自噬活性的預(yù)調(diào)控體系，掌握自噬誘導(dǎo)劑Rapamycin,EBSS，抑制劑3-MA的最佳使用濃度或作用時(shí)間。分別通過(guò)透射電鏡，免疫熒光，免疫印跡技術(shù)研究對(duì)藥物誘導(dǎo)細(xì)胞自噬活性調(diào)控體系的作用進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)微小隱孢子蟲對(duì)不同調(diào)控處理組細(xì)胞的入侵實(shí)驗(yàn)，結(jié)合蟲體入侵評(píng)價(jià)方法計(jì)算微小隱孢子蟲對(duì)不同處理組細(xì)胞的入侵率差異，發(fā)現(xiàn)微