基于Gateway技術(shù)建立的慢病毒載體轉(zhuǎn)染食蟹猴胚胎干細胞的實驗研究.pdf

1、胚胎干細胞是來源于早期胚胎內(nèi)細胞團(inner cell mass，ICM)或桑椹胚的一種多潛能細胞[1]，能在體外自我更新，并且可以在適合的條件下分化為胚胎或成體的各種類型的組織細胞[2]，也可以和宿主囊胚進行嵌合，因而成為當前生物工程研究的熱點，在細胞生物學、發(fā)育生物學、遺傳學、神經(jīng)生物學和1臨床醫(yī)學等領(lǐng)域中發(fā)揮著日益重要的作用[3，4]。由于在倫理、道德等多方面存在爭議，人類胚胎干細胞的相關(guān)研究受到諸多限制[5，6]。而非人靈長類

2、由于在進化地位上與人類的近親關(guān)系而成為基礎(chǔ)研究與臨床醫(yī)用的不可替代的橋梁。非人靈長類胚胎干細胞與人胚胎干細胞具有非常相似的生物學特性。食蟹猴為靈長目猴科，可作為人類發(fā)育的體外模型。此外，食蟹猴胚胎干細胞可為人類胚胎干細胞的研究及應用人胚胎干細胞治療一系列疾病提供經(jīng)驗。 將外源基因通過一定載體轉(zhuǎn)入靶細胞內(nèi)的技術(shù)稱為轉(zhuǎn)基因技術(shù)。目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在干細胞的研究中起著越來越重要的作用。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使干細胞攜帶有標記基因，可以在體內(nèi)實驗

3、中作為示蹤劑，對移植的細胞進行跟蹤；體外實驗中，標記基因便于干細胞的觀察，特別是與其他細胞共培養(yǎng)的體系中，可以清楚的觀察干細胞的變化。 鑒于上述食蟹猴胚胎干細胞和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的重要作用，因此如何能將外源基因高效地轉(zhuǎn)入食蟹猴胚胎干細胞并能在不影響其生物學特性的情況下持續(xù)穩(wěn)定表達就顯得十分必要。目前，轉(zhuǎn)基因的方法有很多種[7]，但靈長類胚胎干細胞由于呈克隆狀生長，生長環(huán)境比較復雜，培養(yǎng)條件比較苛刻，很難轉(zhuǎn)染外源基因而得到較純的克隆，較

4、理想的轉(zhuǎn)染方法多是通過慢病毒載體介導而完成的。慢病毒載體中含有目的基因的載體質(zhì)粒需要根據(jù)實驗要求自行構(gòu)建，傳統(tǒng)的質(zhì)粒構(gòu)建技術(shù)需要酶切、連接等過程，操作過程繁瑣復雜，并且有假陽性的出現(xiàn)，明顯阻礙了實驗的快速進行。因此，近年來興起了一種更為靈活通用的克隆方法-Gateway技術(shù)，Gateway技術(shù)是利用九噬菌體特異性結(jié)合位點可在Clonase的作用下整合到宿主E．coli的基因組中的一種新的通用型克隆技術(shù)。利用Gateway技術(shù)構(gòu)建載體，只

5、需要在目的基因兩端加上特異性的15bp大小的att結(jié)合位點，通過兩種Clonase作用下的BP和LR結(jié)合反應，即可將目的基因?qū)胼d體中，其整合率可達到100％。而且去除了酶切、連接過程，可以避免假陽性的出現(xiàn)。因其操作方便,Gateway技術(shù)近年來在基因工程中的應用已越來越廣泛。有鑒于此，本實驗的主要研究思路是利用Gateway技術(shù)構(gòu)建2K7puto/EF1-α-dTomato和2K7puto/EF1—α-hrGFP兩種載體質(zhì)粒，通過病毒

6、包裝產(chǎn)生慢病毒，然后利用獲得的慢病毒轉(zhuǎn)染食蟹猴胚胎干細胞，通過對轉(zhuǎn)染后的細胞進行純化，得到完全表達dTomato和hrGFP的陽性克隆，并簡單研究這兩種轉(zhuǎn)染后的食蟹猴胚胎干細胞的生物學特性。因此，本研究分為以下兩個部分內(nèi)容： 第一部分：利用Gateway技術(shù)構(gòu)建2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP兩種慢病毒載體。 第二部分：2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7p

7、uro/EF1-α-hrGFP慢病毒載體轉(zhuǎn)染食蟹猴胚胎干細胞的實驗研究。 第一部分利用Gateway技術(shù)構(gòu)建2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP慢病毒載體 1.1 目的: 利用Gateway技術(shù)構(gòu)建2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP兩種載體質(zhì)粒，通過病毒包裝技術(shù)產(chǎn)生相應慢病毒，高速離心后對病毒進行濃縮，測定病毒滴度，并評

8、價病毒的生物安全性，目的在于通過操作簡便的Gateway技術(shù)和病毒包裝技術(shù)構(gòu)建安全、高效的慢病毒載體。 1.2 方法： 1.2.1利用Gateway技術(shù)中涉及到的LR結(jié)合反應，將入門克隆PDONRTM221-dTomato/PDONRTM221-hrGFP和PDONRTML4-EF1-α-R1與目的載體2K7puro進行連接，構(gòu)建2K7puro/EF1-α—dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP載體質(zhì)粒。

9、 1.2.2分別將2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP載體質(zhì)粒與ViraPowerTM Lentiviral Packaging Mix共轉(zhuǎn)染293FT細胞，收集及濃縮病毒。 1.2.3采用梯度稀釋法對病毒滴度進行測定。 1.2.4用病毒原液感染293FT細胞，收集含病毒的條件培養(yǎng)液，再次感染新的293FT細胞，觀察新感染的293FT細胞有無熒光表達，評價病毒的生物安全

10、性。 1.3 結(jié)果： 1.3.1 入門克隆PDONRTM221-dTomato/PDONRTM221-hrGFP 和PDONRTML4-EF1-α-R1與目的載體2K7puro進行LR結(jié)合反應后，得到2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP載體質(zhì)粒，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌后，得到單細菌克隆。 1.3.2將2K7puro/EF1-α—dTomato和2K7puro/EF1-α—

11、hrGFP載體質(zhì)粒與ViraPowerTMLentiviral Packaging Mix共轉(zhuǎn)染239FT細胞48h至72h后，熒光顯微鏡下可觀察到強紅色熒光和綠色熒光并有細胞融合現(xiàn)象，收集病毒上清液高速離心后，可見病毒顆粒沉淀在離心管底部。 1.3.3梯度稀釋法測定本實驗包裝產(chǎn)生的兩種慢病毒2K7puro/EF1-α-dTomatoTto和2K7puro/EF1-α-hrGFP滴度分別為：5.4×107TU/ml和17.6×1

12、07TU/ml。 1.3.4收集感染過上述病毒的293FT細胞的條件培養(yǎng)液，再次感染新的293FT細胞后，未見新感染的293FT細胞有熒光表達，證明上述病毒具有自身滅活作用。 1.4 結(jié)論： 1.4.1成功構(gòu)建2K7puro/EF1-α-dTomato和D2K7puro/EF1-α-hrGFP載體質(zhì)粒。 1.4.2利用2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP載體質(zhì)

13、粒成功包裝產(chǎn)生兩種慢病毒。 1.4.3兩種慢病毒滴度分別為：5.4×107TU/ml和7.6×107TU/ml。 1.4.4病毒生物安全性評價結(jié)果表明病毒感染細胞后無復制能力，培養(yǎng)液中無病毒顆粒釋放。 第二部分2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP慢病毒載體轉(zhuǎn)染食蟹猴胚胎干細胞的實驗研究 2.1目的： 將2K7pruo/EF1-α-dTomato和2K7

14、puro/EE1-α-hrGFP慢病毒載體分別轉(zhuǎn)染cmES，使其分別表達dTomato和qhrGFP，純化轉(zhuǎn)染后的cmES，通過免疫熒光染色鑒定純化后的cmES，并通過體外分化實驗證明純化后的cmES具有多向分化潛能。目的在于通過慢病毒轉(zhuǎn)染這種高效率的轉(zhuǎn)基因方法，得到保持cmES生物學特性的分別表達dTomato和hrGFP的純陽性cmES克隆(dTomato-cmES和hrGFP-cmES)。 2.2方法： 2.2.1

15、分別利用2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP兩種慢病毒載體轉(zhuǎn)染dTomato和hrGFP進)kcmES，熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。 2.2.2利用胰酶消化和連續(xù)機械法傳代兩種方法純化轉(zhuǎn)染后的cmES。 2.2.3 dTomato-cmES和hrGFP—cmES生物學特性的分析：對dTomato-cmES和hrGFP-cmES的分子標記及體外分化能力進行檢測。 2.

16、3結(jié)果： 2.3.1慢病毒轉(zhuǎn)染48h后，熒光倒置顯微鏡下可見部分cmES克隆表達紅色熒光或綠色熒光，克隆均為部分表達熒光，未見純的陽性克隆。轉(zhuǎn)染后的cmES克隆狀態(tài)與轉(zhuǎn)染前無明顯區(qū)別，克隆生長情況良好，僅見極少量的死細胞。 2.3.2胰酶消化轉(zhuǎn)染后的cmES克隆成單細胞或連續(xù)5次以上機械法傳代后，可得到完全表達dTomato和hrGFP的陽性cmES克隆。 2.3.3 dTomato—cmES和hrGFP—cmE

17、S生物學特性：dTomato-cmES和hrGFP-cmES表達OCT-4、SSEA-4和TRA-1-60，而不表達SSEA-1和SSEA-3。dTomato—cmES和hrGFP-cmES自然分化形成的胚體中含有三胚層的細胞。 2.4結(jié)論： 2.4.1成功利用慢病毒轉(zhuǎn)染cmES，轉(zhuǎn)染后的cmES部分表達dTomato或hrGFP，細胞生長基本不受病毒轉(zhuǎn)染的影響。 2.4.2成功獲得完全表達dTomato和hrG