米糠多糖及其硫酸酯的結(jié)構(gòu)、抗腫瘤活性的研究.pdf

1、米糠是稻米加工業(yè)的主要副產(chǎn)品，是我國豐富而可再生的多糖資源。盡管我國米糠產(chǎn)量居世界之首，但由于我國米糠合理利用的基礎(chǔ)理論研究尚處于較低水平，限制了我國米糠潛在價值的進一步精深利用。
　　 本論文在系統(tǒng)研究具有抗腫瘤活性米糠多糖RBPS2a提取、分離純化、結(jié)構(gòu)特征的基礎(chǔ)上，通過硫酸酯化改性得到了抗腫瘤活性更顯著的硫酸酯化米糠多糖SRBPS2a，并對其體內(nèi)外抗腫瘤活性機理以及誘導腫瘤細胞凋亡的分子機制進行了較為深入的研究。具有抗腫瘤

2、活性的硫酸酯化米糠多糖國內(nèi)外還鮮有報道，酯化修飾米糠多糖抑制腫瘤的作用機理和誘導腫瘤細胞凋亡的分子機制國內(nèi)外也尚屬空白，本課題的研究，對于提高米糠多糖的生物利用率，豐富硫酸酯化修飾活性多糖基礎(chǔ)理論，都具有非常重要的現(xiàn)實意義和學術(shù)價值。
　　 運用響應(yīng)面(RSM)和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANNs)分析方法，探討了米糠多糖超聲波提取優(yōu)化工藝。利用響應(yīng)面設(shè)計研究了超聲波功率、超聲時間、提取溫度和料液比對米糠多糖得率的影響。結(jié)果表明，提取溫度(X1

3、)與超聲功率(X2)，二次項中提取溫度(X1×X1)以及提取溫度與超聲功率的交互作用(X1×X2)對響應(yīng)值米糠多糖的得率存在顯著的相關(guān)性。首次采用RBF神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與QPSO優(yōu)化算法結(jié)合的方法，模擬與優(yōu)化米糠多糖的超聲波提取過程，其最優(yōu)工藝條件為：提取溫度82.5℃、超聲波功率335W、提取時間37.5min和料液比18:1。所建立的RBF-QPSO算法對具有多變量、時變性和非線性特征的米糠多糖超聲波提取過程的模擬和優(yōu)化結(jié)果優(yōu)于RSM。

4、r>　　 以體外抑制腫瘤細胞增殖活性為篩選導向，采用Q-Sepharose big beads離子色譜和Sepharose CL-6B凝膠色譜，分離純化得到一種具有抗腫瘤活性的多糖組分RBPS2a。高效凝膠色譜(HPGPC)法測得其呈單一峰，重均分子量9×105 Da。RBPS2a的單糖分析、部分酸水解、甲基化分析、紅外、核磁共振等分析結(jié)果表明，單糖組成為阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖，摩爾比率4：2：1：4；具有一條以β→(1，3)

5、位鍵合的吡喃半乳糖主鏈，有兩個分支殘基，分別是α-D-木糖-(1→4)-α-D-阿拉伯糖-(1→殘基和α-D-葡萄糖-(1→4)-a-D-阿拉伯糖-(1→殘基。
　　 以腫瘤體外增殖抑制為指標，采用氯磺酸-吡啶法，研究米糠多糖的硫酸酯化，優(yōu)化得到米糠多糖硫酸酯化修飾的最佳條件為：氯磺酸和吡啶的比例1:4，反應(yīng)溫度70℃，反應(yīng)時間2h。采用該工藝得到了取代度1.29，分子量3.5×105 Da，具有顯著體外抗腫瘤活性的米糠多糖硫酸

6、酯化衍生物SRBPS2a。通過對比傅立葉紅外光譜和13C核磁共振譜圖，酯化前后結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果證明，米糠多糖RBPS2a經(jīng)硫酸酯化修飾后，主鏈結(jié)構(gòu)保持β-(1→3)-D-甘露糖不變，側(cè)鏈被切除，硫酸基團的取代發(fā)生在C-2和C-4位上，C-6氧化形成糖醛酸甲酯。硫酸酯化米糠多糖較酯化前的米糠多糖顯示出較高的體外抗腫瘤活性，與其酯化后結(jié)構(gòu)的改變有密切關(guān)系。
　　 通過建立小鼠抑制乳腺癌EMT-6模型，研究了SRBPS2a的體內(nèi)抗腫瘤作

7、用機理。結(jié)果表明，SRBPS2a在高(75 mg/kg·d)、中(50 mg/kg·d)劑量下，均具有較為顯著的抑瘤作用，其抑瘤率分別達到55.95%和44.05%。與陽性對照組5-FU相比較，SRBPS2a組小鼠的狀態(tài)良好且脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均有所提高。HE染色結(jié)果顯示，SRBPS2a中劑量組和高劑量組均能使EMT-6腫瘤細胞成團索狀實性排列或彌散狀分布，并發(fā)生腫瘤細胞大片壞死，壞死區(qū)可見凋亡細胞；免疫組化技術(shù)進一步顯示，SRBPS2a

8、能誘導腫瘤組織中Bax基因蛋白表達，同時也能顯著下調(diào)Bcl-2基因蛋白的表達。
　　 SRBPS2a體外對HepG-2腫瘤細胞凋亡機制的研究表明，SRBPS2a作用后其細胞形態(tài)有明顯差異。光鏡下，細胞貼壁形態(tài)異常，細胞數(shù)減少；電鏡觀察顯示，隨著SRBPS2a濃度的增加，細胞表面微絨毛逐漸消失，細胞膜皺縮，外凸形成小泡；熒光電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，高濃度樣品作用下細胞核變小、皺縮，可見致密強熒光。PI單染色流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，SRBPS2a

9、作用后的細胞被阻滯在G2/M期，細胞出現(xiàn)較大的凋亡峰(23.4%)，說明SRBPS2a能有效地誘導腫瘤細胞凋亡。以熒光染料PI和Rh123雙重染色樣作用的細胞，PI(-)和Rh123(-)細胞顯著增加，推測SRBPS2a可能在不影響細胞膜完整性的情況下，誘導HepG-2細胞線粒體膜△ψm下降；采用流式細胞儀檢測結(jié)果表明，SRBPS2a作用48 h后通過上調(diào)HepG-2細胞中促凋亡因子Bax、下調(diào)抑凋亡因子Bcl-2，以及上調(diào)線粒體依賴的