慢病毒介導(dǎo)Galectin-3基因沉默對垂體泌乳素腺瘤細(xì)胞的影響.pdf

1、目的：通過在泌乳素腺瘤細(xì)胞中對Galectin-3進(jìn)行體外基因敲減，為治療泌乳素腺瘤提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為下一步體內(nèi)進(jìn)行垂體泌乳素腺瘤的Galectin-3基因敲除提供重要依據(jù)，初步探討Galectin-3在泌乳素腺瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.泌乳素腺瘤細(xì)胞培養(yǎng)及激素水平的測定：選取經(jīng)單鼻孔蝶竇入路手術(shù)切除的泌乳素腺瘤組織，采用懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法，定時(shí)觀察泌乳素腺瘤細(xì)胞的生長情況，并進(jìn)行激素分泌功能測定。

2、　　2.重組慢病毒載體介導(dǎo)Galectin-3基因沉默對泌乳素腺瘤細(xì)胞的影響的體外研究Galectin-3shRNA慢病毒載體（將其命名為LV-shRNA-Galectin-3）由上海吉?jiǎng)P技術(shù)有限公司包裝制備。
　　將培養(yǎng)的泌乳素腺瘤細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組，分為轉(zhuǎn)染組（LV-shRNA-Galectin-3）,陰性對照組（為無關(guān)序列的發(fā)夾結(jié)構(gòu)病毒載體,由上海吉?jiǎng)P基因提供）和空白對照組（未加任何質(zhì)粒）。將慢病毒載體轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞，分別用Re

3、al-time PCR和Western blot的方法檢測慢病毒載體對Galectin-3的敲除效率，MTT法檢測泌乳素腺瘤細(xì)胞的活力，確定LV-shRNA-Galectin-3介導(dǎo)的RNAi對泌乳素腺瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，各組之間的比較采用方差分析，兩兩組間比較采用SNK法。
　　結(jié)果：
　　1.泌乳素腺瘤細(xì)胞的培養(yǎng)及激素水平測定。

4、>　　相差倒置顯微鏡下觀察，原代培養(yǎng)的泌乳素腺瘤細(xì)胞呈橢圓形或梭形，24h后有部分泌乳素腺瘤開始半貼壁生長，大部分呈懸浮生長。于培養(yǎng)的約第10天開始，成纖維細(xì)胞數(shù)量開始增多，并逐漸取代泌乳素腺瘤細(xì)胞。換下的培養(yǎng)液采用放射免疫方法檢測。測定結(jié)果顯示泌乳素腺瘤細(xì)胞分泌的激素水平在第7天左右最佳。
　　2.shRNA在泌乳素腺瘤細(xì)胞中對Galectin-3敲減效率。
　　Real-time PCR結(jié)果顯示LV-shRNA-Gale

5、ctin-3轉(zhuǎn)染泌乳素腺瘤細(xì)胞后，其 Galectin-3的mRNA的表達(dá)比未敲減組降低了70％以上，p＜0.05，陰性對照組和空白組表達(dá)水平?jīng)]有明顯下降。
　　Western Blot檢測結(jié)果顯示，shRNA明顯降低泌乳素腺瘤細(xì)胞中Galectin-3的蛋白表達(dá)，抑制效率達(dá)到70％以上，p＜0.05，而陰性對照組與空白組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＞0.05。
　　3. MTT法檢測泌乳素腺瘤細(xì)胞的增殖能力。
　　轉(zhuǎn)