熱楊1號(hào)再生體系的建立及轉(zhuǎn)雙抗蟲基因的研究.pdf

1、楊樹是近年來我國大力推廣的速生樹種之一，它不僅是重要的防風(fēng)樹種，也是重要的木材用樹。但是，蟲害是楊樹育種中面臨的一個(gè)嚴(yán)重問題，化學(xué)殺蟲劑容易使害蟲產(chǎn)生耐藥性并污染環(huán)境。因此利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗蟲楊樹新品種已成為當(dāng)前植物遺傳改良的重要手段。本研究以熱楊1號(hào)(PopulusXeuramericanacv.'Reyang1')為實(shí)驗(yàn)材料，采用植物組織培養(yǎng)、植物基因工程和分子生物學(xué)的有關(guān)技術(shù)，建立了熱楊1號(hào)的再生體系并對雙抗蟲基因遺傳轉(zhuǎn)化熱楊1

2、號(hào)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.研究了不同外植體、不同激素濃度配比對熱楊1號(hào)愈傷組織、不定芽和根誘導(dǎo)的影響，獲得了熱楊1號(hào)高效再生體系。實(shí)驗(yàn)表明以熱楊1號(hào)葉脈為外植體的再生能力明顯高于其他外植體，并篩選出誘導(dǎo)愈傷組織、不定芽和根的最佳培養(yǎng)基。切取葉脈接種在MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉5.5g/L的培養(yǎng)基上，經(jīng)過1周左右開始出現(xiàn)愈傷組織，并且愈傷組織的誘導(dǎo)率高達(dá)90％；把愈傷

3、組織接種到Ms+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+IBA0.1mg/L+椰子水5％+蔗糖30g/L+瓊脂粉5.5g/L的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽再生，25d左右可看到不定芽的形成，誘導(dǎo)率達(dá)87％；再生芽在1/2MS+NAA0.05mg/L+IBA0.15mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂粉5.5g/L的生根培養(yǎng)基上經(jīng)過25d左右可誘導(dǎo)出根，生根率可達(dá)94％。 2.測定了愈傷組織對Kan的抗性，得出熱楊1號(hào)愈傷組織對Kan的敏

4、感的最佳濃度為50mg/L。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍轟擊法將一個(gè)構(gòu)建在載體上的雙抗蟲基因(BtCryI基因和慈姑蛋白酶抑制劑基因API)轉(zhuǎn)化熱楊1號(hào)。 3.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的研究中發(fā)現(xiàn)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、乙酰丁香酮對熱楊1號(hào)的遺傳轉(zhuǎn)化率均有較大影響。預(yù)培養(yǎng)2d、共培養(yǎng)24h，添加100mg/L的乙酰丁香酮的遺傳轉(zhuǎn)化率最高。共培養(yǎng)后轉(zhuǎn)至MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+IBA0.1mg/L+椰子

5、水5％+蔗糖30g/L+瓊脂粉5.5g/L培養(yǎng)基上進(jìn)行分化篩選培養(yǎng)，3個(gè)月后，經(jīng)過4-6次篩選的抗性愈傷組織部分分化出芽。轉(zhuǎn)到1/2MS+NAA0.05mg/L+IBA0.15mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂粉5.5g/L+Car100mg/L+Kan50mg/L培養(yǎng)基上進(jìn)行生根篩選。 4.利用基因槍法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的研究中，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、轟擊距離對熱楊1號(hào)的遺傳轉(zhuǎn)化率有較大影響。確定了基因槍轉(zhuǎn)化熱楊1號(hào)的有關(guān)參數(shù)：轟擊前，愈傷組織無

6、需高滲預(yù)處理2d，轟擊距離：6cm，轟擊次數(shù)：1次。 5.經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化所獲得的47株轉(zhuǎn)化植株中有45株苗PCR檢測呈陽性。SouthernBlot檢測的結(jié)果為4株苗有雜交信號(hào)。證明外源雙抗蟲基因已整合到熱楊1號(hào)基因組中。 6.利用基因槍法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化所獲得的52株轉(zhuǎn)化植株中有39株苗PCR檢測呈陽性，SouthernBlot檢測的結(jié)果為3株苗有雜交信號(hào)。證明外源雙抗蟲基因已整合到熱楊1號(hào)基因組中。