腺病毒介導(dǎo)TIMP-4基因轉(zhuǎn)染對血管平滑肌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、背景和目的:血管新生內(nèi)膜形成是PTCA和支架術(shù)后RS的病理基礎(chǔ),VSMC的遷移則是新生內(nèi)膜形成的關(guān)鍵步驟,必須首先突破ECM的束縛方能穿過內(nèi)彈力膜發(fā)生遷移形成新生內(nèi)膜.ECM的穩(wěn)定是維持血管壁完整性的重要基礎(chǔ),MMPs及其組織抑制因子TIMPs是維持ECM穩(wěn)態(tài)最重要的蛋白酶家族.血管損傷后,受損血管局部的VSMC在各種細(xì)胞因子的刺激下發(fā)生細(xì)胞表型的改變,由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?分泌大量的MMPs,打破了維持ECM穩(wěn)態(tài)的MMPs/TIMPs

2、動(dòng)態(tài)平衡,分泌到胞外的MMPs使ECM蛋白發(fā)生降解,從而解除了ECM對VSMC的束縛,打通了VSMC遷移的道路,因此,MMPs可能在新生內(nèi)膜形成過程中扮演了分子開關(guān)的角色.由此可見,維持MMPs與TIMPs之間的動(dòng)態(tài)平衡是十分重要的.近年來的一些研究證實(shí),血管損傷時(shí)局部過表達(dá)TIMP-l、TIMP-2和TIMP-3均可明顯減少VSMC遷移、抑制新生內(nèi)膜增生.TIMP-4作為TIMPs家族的新成員,表達(dá)具有心臟特異性.目前關(guān)于TIMP-4

3、生物學(xué)功能的研究報(bào)道較少,是否也會對VSMC的遷移與增殖產(chǎn)生影響,尚未見報(bào)道.該實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了攜帶TIMP-4基因的重組腺病毒載體,通過轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠VSMC,研究增強(qiáng)其表達(dá)對VSMC增殖、遷移等生物學(xué)行為的影響,以進(jìn)一步明確TIMP-4的生物學(xué)活性,為TIMP-4在RS防治研究中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)證據(jù).方法:①采用位置特異性重組方法構(gòu)建攜帶人TIMP-4基因表達(dá)序列的復(fù)制缺陷型5型腺病毒載體,經(jīng)293細(xì)胞擴(kuò)增,純化制備高滴度病毒

4、轉(zhuǎn)染液.將獲贈(zèng)的對照病毒Ad.LacZ以相同方法進(jìn)行擴(kuò)增和純化;②采用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈VSMC,以形態(tài)學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定;③以病毒轉(zhuǎn)染液常規(guī)轉(zhuǎn)染VSMC后,應(yīng)用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)和蛋白免疫印跡等方法分別檢測TIMP-4基因在VSMC轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá);④以酶譜法(zymography)和逆向酶譜法(reverse zymography)檢測VSMC表達(dá)分泌的TIMP-4的蛋白活性;⑤應(yīng)用帶Matrigel基底膜

5、基質(zhì)的Millicell培養(yǎng)小室研究TIMP-4表達(dá)對VSMC遷移的影響,應(yīng)用四唑鹽(MTT)比色實(shí)驗(yàn)、3H標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)摻入實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀等檢測TIMP-4表達(dá)對VSMC增殖的影響; 結(jié)果:①應(yīng)用DNA重組技術(shù),成功構(gòu)建了攜帶TIMP-4基因的重組穿梭質(zhì)粒載體pDC315.TIMP-4,將其與腺病毒基因組質(zhì)粒pBHGlox△E1,3cre在脂質(zhì)體介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,通過位置特異性重組,經(jīng)PCR法篩選、鑒定,成

6、功獲得了攜帶TIMP-4基因的人類5型復(fù)制缺陷型腺病毒Ad.TIMP-4.構(gòu)建的Ad.TIMP-4通過大量復(fù)制和純化,獲得滴度約5×10<'10>pfu/ml.對照病毒Ad.LacZ經(jīng)擴(kuò)增、純化,獲得滴度為7.5×1010pfu/ml.Ad.TIMP-4和Ad.LacZ的最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)均為100MOI;②采用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈VSMC,經(jīng)形態(tài)學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定證實(shí)為VSMC,6~8代時(shí)VSMC純度幾近100﹪;③通過RT-P

7、CR、免疫細(xì)胞化學(xué)法和蛋白免疫印跡等方法表明,正常培養(yǎng)的VSMC不表達(dá)TIMP-4,Ad.TIMP-4轉(zhuǎn)染VSMC后檢測TIMP-4細(xì)胞表達(dá)率、mRNA和蛋白表達(dá)的結(jié)果均證明VSMC成功表達(dá)了TIMP-4,表達(dá)率隨轉(zhuǎn)染時(shí)間延長逐漸增加,轉(zhuǎn)染后2d可達(dá)86.5﹪,高水平的表達(dá)可維持6d以上;④酶譜法和逆向酶譜法結(jié)果證明Ad.TIMP-4轉(zhuǎn)染VSMC后表達(dá)分泌的TIMP-4具有抑制MMPs的生物學(xué)活性.在實(shí)驗(yàn)過程中對檢測TIMP-4生物學(xué)活

8、性的酶譜法和逆向酶譜法進(jìn)行了優(yōu)化;⑤Ad.TIMP-4轉(zhuǎn)染VSMC后,TIMP-4表達(dá)可顯著抑制PDGF趨化作用引起的VSMC遷移,并且隨轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長,TIMP-4表達(dá)增多,遷移的VSMC數(shù)呈更加減少的趨勢.與Ad.LacZ組相比,VSMC遷移數(shù)最大減少78.7﹪;⑥Ad.TIMP-4轉(zhuǎn)染VSMC后,TIMP-4表達(dá)可顯著抑制VSMC增殖.與Ad.LacZ組相比,MTT吸光度降低最大達(dá)47.1﹪,3H-TdR摻入量降低最大達(dá)30.7﹪

9、,G<,0>-G<,1>期的VSMC比例顯著增高,G1- M期和S期細(xì)胞比例顯著降低; 結(jié)論:①用構(gòu)建的復(fù)制缺陷型腺病毒Ad.TIMP-4轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈VSMC, 可使TIMP-4在VSMC中高效表達(dá),并具有生物學(xué)活性;②Ad.TIMP-4轉(zhuǎn)染VSMC后,TIMP-4的表達(dá)可顯著抑制VSMC的遷移和增殖;③TIMP-4對VSMC生物學(xué)行為的影響為RS的基因防治研究提供了新的思路;④用改建的PTCA球囊建立了大鼠頸總動(dòng)脈新生內(nèi)膜增殖