腺病毒介導(dǎo)的RNAi沉默CD147基因?qū)-24膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、研究背景：
　　 膀胱癌是我國(guó)泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤。90％以上源自于移行上皮,初發(fā)病例中75％為表淺性腫瘤(pTis,pTa,pT1),25％在初診時(shí)為侵潤(rùn)性腫瘤或者已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切(TURBT)輔以術(shù)后膀胱灌注化療是現(xiàn)階段治療表淺性膀胱腫瘤的主要手段,但術(shù)后復(fù)發(fā)率可高達(dá)85％,一旦復(fù)發(fā),其生物學(xué)行為也隨之改變,往往向更高的病理分級(jí)及臨床分期發(fā)展,超過(guò)20％的復(fù)發(fā)性腫瘤最終進(jìn)展為侵潤(rùn)性癌。相對(duì)于表淺性腫瘤來(lái)

2、說(shuō),侵潤(rùn)性病變治療棘手,預(yù)后也明顯不同。盡管膀胱癌根治術(shù)被認(rèn)為是治療侵潤(rùn)性膀胱癌(pT2-pT4)的金標(biāo)準(zhǔn),但有50％的患者在術(shù)后2年內(nèi)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,而且大大降低了患者的生活質(zhì)量,患者5年生存率不到50％。因此,尋求新的干預(yù)策略對(duì)提高膀胱癌的療效具有特殊的迫切性和重要性。
　　 造成膀胱癌患者死亡的主要因?yàn)槭前螂装┑那忠u性。其侵襲過(guò)程中的一個(gè)重要因素是細(xì)胞外基質(zhì)的降解,其中,起重要作用的是一類(lèi)Zn2+依賴(lài)的基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs

3、(Matrix Metalloproteinases)。MMPs能夠破壞局部組織結(jié)構(gòu)和基底膜屏障,促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,并且可促進(jìn)腫瘤新生血管的形成。CD147亦稱(chēng)EMMPRIN,是單次跨膜糖蛋白,屬于免疫球蛋白超家族(IgSF)成員。CD147在多種惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),其表達(dá)水平和腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。CD147主要刺激腫瘤細(xì)胞和鄰近的纖維母細(xì)胞分泌大量的MMPs,通過(guò)影響腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管形成等促進(jìn)惡性腫瘤的侵襲和

4、轉(zhuǎn)移。CD147分子還可以通過(guò)旁分泌途徑促進(jìn)MMPs產(chǎn)生；在腫瘤細(xì)胞表面與MMP-1形成復(fù)合物,使腫瘤細(xì)胞表面局部MMPs聚集,有利于其發(fā)揮降解膠原作用,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲。
　　 然而,CD147是否參與調(diào)節(jié)膀胱癌的侵潤(rùn)及轉(zhuǎn)移過(guò)程尚未見(jiàn)報(bào)道。為了研究CD147和膀胱癌之間的關(guān)系,我們首先應(yīng)用免疫組化檢測(cè)CD147基因在膀胱癌組織中的表達(dá)情況,分析CD147與膀胱癌分期、分級(jí)等臨床病理參數(shù)的關(guān)系,然后針對(duì)CD147構(gòu)建了RN

5、A干擾載體,觀察其對(duì)離體膀胱癌T-24細(xì)胞侵襲的抑制作用,闡明膀胱癌進(jìn)展的分子機(jī)制,為研究膀胱癌更有效的治療手段提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究方法
　　 1、免疫組化檢測(cè)CD147在膀胱癌組織中的表達(dá)情況,分析CD147與膀胱癌分期、分級(jí)等臨床病理參數(shù)的關(guān)系。
　　 2、CD147基因siRNA重組腺病毒載體(Ad-CD147 siRNA)的構(gòu)建及效果鑒定。
　　 (1)RT-PCR檢測(cè)Ad-CD147

6、 siRNA對(duì)人膀胱癌T-24細(xì)胞CD147基因mRNA表達(dá)的影響。
　　 (2)Western Blot檢測(cè)Ad-CD147 siRNA對(duì)人膀胱癌T-24細(xì)胞CD147基因蛋白表達(dá)的影響。
　　 3、Ad-CD147 siRNA對(duì)膀胱癌T-24細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響
　　 (1)MTT檢測(cè)Ad-CD147 siRNA對(duì)T-24細(xì)胞增殖能力的影響。
　　 (2)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ad-CD147 siR

7、NA對(duì)T-24細(xì)胞遷移能力的影響。
　　 (3)Transwell檢測(cè)Ad-CD147 siRNA對(duì)T-24細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　 (4)明膠酶譜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)T-24細(xì)胞感染Ad-CD147 siRNA后MMP-2、MMP-9的分泌情況。
　　 (5)RT-PCR檢測(cè)T-24細(xì)胞感染Ad-CD147 siRNA后VEGF mRNA表達(dá)水平。
　　 (6)ELISA檢測(cè)T-24細(xì)胞感染Ad-CD147 si

8、RNA后VEGF分泌水平。
　　 研究結(jié)果
　　 1、CD147在正常膀胱癌組織中無(wú)表達(dá)或表達(dá)非常微弱,相反,在膀胱癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為73.6％(59/80),CD147表達(dá)于腫瘤細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中,此研究結(jié)果說(shuō)明與正常膀胱組織相比,膀胱癌組織中CD147存在過(guò)度表達(dá)。不同分期、分級(jí)膀胱癌細(xì)胞著色結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),CD147表達(dá)與膀胱癌分期(P=0.033)、分級(jí)(P=0.028)相關(guān),而與年齡(P=0.276)、性別(P=

9、0.196)無(wú)關(guān),說(shuō)明膀胱癌細(xì)胞不僅表達(dá)CD147,并且其表達(dá)程度與膀胱癌惡性程度成正比。
　　 2、成功構(gòu)建了針對(duì)CD147基因的siRNA重組腺病毒表達(dá)載體(Ad-CD147siRNA),RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示,Ad-CD147 siRNA高效而特異地沉默了膀胱癌T-24細(xì)胞CD147基因的表達(dá)。MOI=100時(shí),干擾效應(yīng)達(dá)90％以上。
　　 3、MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Ad-CD147 siRN

10、A感染T-24細(xì)胞3、4和5天后,細(xì)胞增殖水平顯著下降,和未感染組(Mock)相比,其下降率分別為38％,41％和43％(P<0.01)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中,Ad-CD147 siRNA感染T-24細(xì)胞后,細(xì)胞遷移能力顯著下降,Ad-CD147 siRNA感染組,陰性對(duì)照組(Ad-siControl)和未感染組(Mock)的細(xì)胞遷移距離分別為0.85mm、1.73mm和1.8 mm(P<0.01)。Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,A

11、d-CD147 siRNA感染后,T-24細(xì)胞侵襲能力顯著下降,與未感染組(Mock)和陰性對(duì)照組(Ad-siControl)相比,其侵襲能力分別分別下降了75％和70％(P<0.01)。明膠酶譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與未感染組(Mock)相比,Ad-CD147 siRNA感染組MMP-2、MMP-9的分泌量分別下降了68.5％和37.1％(P<0.01)。VEGF RT-PCR和ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn),與未感染組(Mock)相比,Ad-CD147

12、 siRNA感染組顯著下降了VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平,其下降率分別為57.2％和56.5％(P<0.01)。
　　 結(jié)論
　　 1、CD147基因在膀胱癌組織中存在過(guò)度表達(dá),其表達(dá)強(qiáng)度與膀胱癌的分期、分級(jí)相關(guān),可能作為判斷膀胱癌是否具備高轉(zhuǎn)移潛能的指標(biāo)。
　　 2、構(gòu)建了CD147基因siRNA重組腺病毒載體。
　　 (1)感染T-24細(xì)胞,經(jīng)RT-PCR和Western-Blot檢測(cè),CD147

13、分子在mRNA和蛋白水平被阻斷。
　　 (2)功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,RNAi較好地抑制了膀胱癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。主要表現(xiàn)在:
　　 ①細(xì)胞的增殖和遷移能力明顯下降。
　　 ②RNAi封閉的膀胱癌細(xì)胞自身分泌MMPs和VEGF的能力的能力大 為減弱。
　　 ③在MMPs和VEGF分泌量減少的情況下,膀胱癌細(xì)胞降解膠原和血管形成能力下降,侵襲力減弱。
　　 3、用siRNA阻斷CD147基因的表達(dá),有可能