NDRG2調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的機制研究及其腸道特異性Ndrg2基因敲除小鼠的建立.pdf

1、人源N-Myc downstream regulated gene2（NDRG2）基因是我們課題組首先發(fā)現(xiàn)并報道的新的抑癌候選基因，廣泛表達(dá)于腦、心、肝、骨骼肌等分化程度較高的組織中。NDRG2參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生理過程。
　　前期的研究表明，NDRG2作為一個抑癌候選基因，在膠質(zhì)瘤、乳腺癌、肝癌、胃癌、結(jié)腸癌等惡性程度較高的腫瘤組織中，以及在多種腫瘤細(xì)胞系中低表達(dá)或不表達(dá)。在MCF7和CaCo2等腫瘤細(xì)胞系中過表達(dá)N

2、DRG2可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。在結(jié)腸癌組織中，NDRG2參與調(diào)控E-cadherin和TGF-β，調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。我們的研究也表明，NDRG2在結(jié)直腸癌病人的腫瘤組織中的表達(dá)豐度與腫瘤的惡性程度和腫瘤分期呈負(fù)相關(guān)性，同時也與結(jié)直腸癌病人的愈后和5年存活率呈正相關(guān)。目前為止，對NDRG2功能的認(rèn)知尚不是十分明確。
　　Hepatocyte Growth Factor（HGF）是一個多功能的細(xì)胞生長因子，通過結(jié)合c

3、-MET調(diào)控下游PI3K/Akt、MEK/ERK、JAK/STAT等信號通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡和遷移等生理過程，是組織器官發(fā)育的重要調(diào)控通路。c-MET的高表達(dá)或突變激活對于膠質(zhì)瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移都有重要的影響。HGF通過調(diào)控MEK/ERK和NF-κB等信號通路促進肺泡Ⅱ型細(xì)胞、黑色素瘤和胃癌等腫瘤細(xì)胞系的增殖，但在某些腫瘤細(xì)胞系（HepG2、Huh7、HT29、HT115等）中，HGF則發(fā)揮增殖

4、抑制的功能。這種差異可能與HGF/c-MET信號通路與其他信號通路的交聯(lián)所導(dǎo)致的。
　　轉(zhuǎn)基因小鼠模型為基因的在體功能研究提供了很好的研究策略。NDRG2對細(xì)胞增殖的調(diào)控作用已被多項實驗所證實，我們通過Villi-Cre和Ndrg2-Loxp基因敲除系統(tǒng)構(gòu)建了Ndrg2的腸上皮細(xì)胞特異性敲除小鼠，初步分析Ndrg2對小鼠的小腸和結(jié)腸發(fā)育的影響，并從動物實驗的結(jié)果中分析NDRG2可能參與結(jié)腸癌發(fā)生和發(fā)展過程中的分子機制，為下一步研究

5、打下基礎(chǔ)。
　　蛋白的翻譯后修飾在蛋白功能發(fā)揮過程中發(fā)揮重要作用，特別是蛋白質(zhì)的賴氨酸乙酰化修飾廣泛參與了蛋白質(zhì)的降解、轉(zhuǎn)位和分泌等諸多生理過程。我們初步分析了NDRG2的蛋白質(zhì)序列，結(jié)果顯示有三個比較保守的賴氨酸位點。我們分別針對這三個位點進行特異性組成型活化的突變（賴氨酸突變?yōu)楣劝滨０罚┖徒M成型失活的突變（賴氨酸突變?yōu)榫彼幔芯縉DRG2蛋白序列中這三個賴氨酸位點的功能。
　　我們的研究表明，NDRG2過表達(dá)可以抑制

6、結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。那么我們推測，在結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29細(xì)胞中，NDRG2對細(xì)胞增殖的抑制依賴于HGF/c-MET信號
　　通路。同時，我們發(fā)現(xiàn)腸道特異性的Ndrg2基因敲除小鼠的小腸和結(jié)腸有明顯的表型變化，提示Ndrg2可能參與了小鼠腸道發(fā)育的調(diào)控過程。我們將在下一步工作中，致力于揭示NDRG2調(diào)控小鼠小腸和結(jié)腸發(fā)育過程的分子機制，進一步明確NDRG2的功能。
　　目的；
　　（1）闡明NDRG2調(diào)控HGF/c-MET

7、信號通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的分子機制。
　?。?）構(gòu)建Ndrg2腸上皮細(xì)胞基因特異敲除小鼠，并分析其表型變化。
　　（3）初步明確NDRG2乙?；揎椢稽c及其功能的影響。
　　方法；
　?。?）構(gòu)建NDRG2過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，并以Real-time PCR和Western blot檢測NDRG2對HGF、c-MET及其下游分子的影響。
　　（2）構(gòu)建Ndrg2腸上皮細(xì)胞基因特異敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠，通過West

8、ern blot和免疫組化驗證N DRG2的敲除效果，并對基因特異敲除小鼠的表型做初步分析。
　?。?）構(gòu)建NDRG2特定賴氨酸位點突變的表達(dá)載體，明確對NDRG2的乙?；揎椝郊捌涔δ艿挠绊?。
　　結(jié)果：
　　（1）NDRG2通過調(diào)控HGF/c-MET信號通路，抑制HT29細(xì)胞的增殖。HGF激活c-MET和下游分子ERK1/2的磷酸化，上調(diào)下游分子p21和p27的表達(dá)，從而抑制HT29細(xì)胞的增殖。而在HT29細(xì)胞中

9、過表達(dá)NDRG2可以上調(diào)HGF的表達(dá)和c-MET的磷酸化水平，并調(diào)控下游分子p21和p27的高表達(dá)，從而抑制細(xì)胞的增殖。
　　（2）NDRG2對C57/BL6小鼠的小腸和結(jié)腸的發(fā)育的影響。Ndrg2腸上皮細(xì)胞基因特異敲除小鼠的小腸和結(jié)腸中，NDRG2的敲除效果比較明顯，同時，相比于野生型小鼠，Ndrg2基因敲除小鼠的小腸和結(jié)腸的長度顯著變長。
　　（3）構(gòu)建NDRG2點突變的突變體的表達(dá)載體。構(gòu)建了NDRG2在K171、K2

10、73、K288三個賴氨酸位點的突變體，包括K171R、K273R、K288R三個由賴氨酸（K）突變?yōu)榫彼幔≧）的突變體，和K171Q、K273Q、K288Q三個由賴氨酸（K）突變?yōu)楣劝滨０罚≦）的突變體，并驗證了突變體的表達(dá)。
　　討論：
　　NDRG2通過調(diào)控HGF/c-MET信號，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29細(xì)胞的增殖；但具體的調(diào)控機制還需要進一步研究；NDRG2可以參與小鼠小腸和結(jié)腸的發(fā)育過程，進而影響小鼠的小腸和結(jié)腸的