RNAi干擾沉默PTP4A1基因對舌鱗癌細胞TCA8113生物學行為影響的研究.pdf

1、第一部分PTP4A1基因在舌鱗癌組織中的表達及臨床意義
　　 目的:檢測肝細胞再生磷酸因子-1(protein tyrosine phosphatase typeIVA，member1，PTP4A1)在舌鱗癌中的表達情況，并分析其表達水平與舌鱗癌臨床病理參數(shù)的關系。
　　 方法:采用免疫組織化學法（SP法）檢測15例正常舌組織、30例舌鱗癌組織石蠟包埋切片中PTP4A1的表達;對15例新鮮舌鱗癌組織進行realtime-

2、PCR，檢測PTP4A1 mRNA在舌癌組織、癌旁組織、正常舌組織的表達。
　　 結果:PTP4A1在舌鱗癌組織中呈陽性和強陽性表達，多見于細胞質和細胞核內，而在正常舌組織中呈陰性和弱陽性表達;PTP4A1在舌鱗癌的陽性表達率為83％，顯著高于其在正常舌組織中的表達率33.3％;PTP4A1在舌癌組織和正常舌組織的表達有顯著性差異（P＜0.05);而且PTP4A1的表達水平與腫瘤的淋巴轉移相關（P＜0.05)，而與病人的性別、年

3、齡、腫瘤的大小、腫瘤的分期分級無明顯相關。realtime-PCR實驗結果顯示舌癌組織及舌癌細胞系TCA8113細胞中的PTP4A1的mRNA表達水平高于其在癌旁和正常舌組織的表達，癌旁組織的表達高于正常舌組織的表達（P＜0.05)。
　　 結論:PTP4A1基因mRNA水平和蛋白水平表達在舌癌組織中高表達，可能在舌鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著一定作用。
　　 第二部分PTP4A1基因RNAi慢病毒載體的構建與鑒定
　

4、　 目的:構建shRNA PTP4A1的慢病毒載體，并檢測其在TCA8113舌鱗癌細胞株對PTP4A1的抑制效果，且篩選出穩(wěn)定感染的細胞株。
　　 方法:設計合成五對針對靶基因（PTP4A1 mRNA）的shRNA寡核苷酸序列，分別構建質粒，轉染293T細胞，根據(jù)其對293T細胞PTP4A1基因的抑制率篩選出最有效的PTP4A1基因的RNAi靶序列，設計并合成siRNA的雙鏈DNA Oligo，與含綠色熒光蛋白(GFP)編碼基

5、因的hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin重組慢病毒載體siRNA-PTP4A1，共轉染293T細胞，包裝產生慢病毒，以GFP蛋白的表達水平測定病毒滴度。用realtime-PCR和western-blot檢測重組慢病毒質粒感染TCA8113細胞后對PTP4A1基因的干擾效果。
　　 結果:酶切電泳分析以及DNA測序證實成功構建了PTP4A1基因RNAi慢病毒載體，獲得相應的慢病毒，濃縮病毒懸

6、液的滴度7.0E+8TU/ml。和對照組相比RNA干擾組TCA8113細胞PTP4A1基因的mRNA和蛋白水平的抑制率分別為55％和60％以上（P＜0.05)。并成功篩選出穩(wěn)定感染的舌鱗癌細胞株。
　　 結論:構建的重組慢病毒siRNA-PTP4A1載體能有效的抑制PTP4A1基因在舌鱗癌細胞TCA8113的表達，且成功的篩選出其穩(wěn)定表達的細胞株，為下一步的研究打下基礎。
　　 第三部分RNA干擾沉默PTP4A1基因的表

7、達對舌鱗癌細胞TCA8113的體內外生物學特性的影響
　　 目的:研究沉默舌鱗癌細胞TCA8113中基因PTP4A1的表達對其體內外生物學行為的影響及其機制的探討。
　　 方法:分別檢測PTP4A1下調前后的舌鱗癌細胞TCA8113生物學特性的變化，MTT法檢測細胞增殖;流式細胞分析細胞周期和凋亡;平板克隆形成實驗檢測克隆形成能力;transwell小室檢測細胞侵襲的影響;利用Western-blot檢測bcl-2、ba

8、x蛋白水平表達的變化，以及realtime-PCR檢測MMP2、MMP9在mRNA表達水平的變化;通過裸鼠的移植瘤模型觀察舌鱗癌細胞TCA8113下調基因PTP4A1表達后在裸鼠皮下移植瘤的生長情況。
　　 結果:下調PTP4A1的表達后，MTT結果顯示KD組細胞增殖能力小于NC、CON組;細胞凋亡率也明顯增加，KD組早期凋亡為(17.48±0.70)％，而NC、CON組的早期細胞凋亡率為(7.34±0.70)％和(4.86±0

9、.25)％(P＜0.01);KD組細胞周期阻滯在G1/G0和S期(P＜0.05);Western blot結果顯示bcl-2蛋白表達降低(P＜0.01)，bax蛋白表達增高(P＜0.01);KD組體外克隆形成數(shù)小于NC、CON組(P＜0.01);穿過人工基地膜的平均數(shù)為(35±6)明顯少于CON組(134±8.882)及NC干擾組(123±6.557)，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01);沉默PTP4A1基因的表達后細胞的MMP2和MMP