天花粉蛋白誘導(dǎo)人宮頸瘤Hela細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究天花粉蛋白在體外對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用，以期發(fā)現(xiàn)一種通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來抑制宮頸癌細(xì)胞生長的新的有效藥物;探討天花粉蛋白誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡的分子機(jī)制，為擴(kuò)大天花粉蛋白的抗宮頸癌用藥奠定科學(xué)的理論基礎(chǔ)。 方法：取對(duì)數(shù)生長期的人宮頸癌Hela細(xì)胞，用天花粉蛋白處理后，從形態(tài)學(xué)觀察、MTT細(xì)胞活力測(cè)定、DNA瓊脂糖凝膠電泳及流式細(xì)胞儀分析等方面檢測(cè)天花粉蛋白對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)，利用免

2、疫印跡方法及基因芯片技術(shù)檢測(cè)天花粉蛋白處理前后人宮頸癌Hela細(xì)胞的基因表達(dá)譜改變。 結(jié)果：天花粉蛋白在體外作用人宮頸癌Hela細(xì)胞以后, 形態(tài)學(xué)觀察可見細(xì)胞體積縮小, 胞漿凝縮, 折光率增強(qiáng)，部分貼壁細(xì)胞圓縮變成懸浮細(xì)胞; MTT法檢測(cè)人宮頸癌Hela細(xì)胞的活力，發(fā)現(xiàn)20ug/ml的天花粉蛋白作用48小時(shí)后即對(duì)Hela細(xì)胞的生長有抑制作用,在20ug/ml至120 ug/ml的濃度范圍內(nèi),隨著藥物濃度的增加及作用時(shí)間的延長，天

3、花粉蛋白對(duì)HeLa細(xì)胞的生長抑制率逐漸增大；DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示HeLa細(xì)胞核DNA降解為180—200bp的片段,出現(xiàn)典型的梯級(jí)格局（DNA ladder）；流式細(xì)胞儀分析可見凋亡細(xì)胞在直方圖上出現(xiàn)特征性的亞二倍體峰（sub-G1 peak），且隨著藥物濃度的增大及作用時(shí)間的延長，凋亡細(xì)胞的比例增加。Westernblot結(jié)果示天花粉蛋白對(duì)凋亡相關(guān)基因bcl-2及bax基因的表達(dá)有影響，隨著藥物濃度的增加，bax基因表達(dá)增加而bc

4、l-2基因表達(dá)減少；基因芯片檢測(cè)到78條差異表達(dá)的基因, 其中,與細(xì)胞黏附及細(xì)胞間相互作用相關(guān)的MGST3、LGALS3BP 、RGS5等16條基因表達(dá)下降，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的BAX、CASP9、DFF、P53等62條基因表達(dá)上調(diào)。 結(jié)論：天花粉蛋白在體外能明顯抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞的生長，這種抑制作用是通過其誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的，天花粉蛋白可能通過如下途徑誘導(dǎo)人宮頸癌Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡：（1）外界刺激→

5、bax/ bcl-2 →細(xì)胞素C → caspase-3 → DFF路徑：凋亡信號(hào)引起bax基因表達(dá)升高而bcl-2基因表達(dá)下降，允許一些離子和小分子如細(xì)胞色素c等穿過線粒體膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，激活caspase-3后進(jìn)一步激活DFF，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的典型特征。（2）TNF配體與受體結(jié)合→ caspase-8→ caspase-3 → DFF途徑：TNF配體與受體結(jié)合后激活caspase-8，引發(fā)caspase家族級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡；（3）