歐美楊108再生體系的優(yōu)化及轉(zhuǎn)天花粉蛋白基因的研究.pdf

1、本文以歐美楊108無菌苗為材料，通過對(duì)基本培養(yǎng)基的篩選、激素種類和濃度的調(diào)整，培養(yǎng)條件的選擇等優(yōu)化了歐美楊108再生體系的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。在此基礎(chǔ)上，采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，進(jìn)行抗病蟲天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)基因的遺傳轉(zhuǎn)化研究。探討了影響轉(zhuǎn)化效率的若干因子，首次建立了以潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)為選擇標(biāo)記基因的歐美楊108遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，并獲得了抗性愈傷和抗性芽。經(jīng)PCR和PCR-Southern檢測(cè)，證明目的基因

2、已經(jīng)整合到歐美楊108基因組中，為進(jìn)一步開展歐美楊108遺傳轉(zhuǎn)化打下了理論基礎(chǔ)?！　≈饕芯拷Y(jié)果如下：通過篩選得到了優(yōu)化的葉片分化再生培養(yǎng)基、莖段愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、不定芽生根培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。葉片分化時(shí)，采用MS培養(yǎng)基附加0.6mg·L-16-BA和0.2mg·L-1NAA，在光照條件下培養(yǎng)；莖段愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)，采用WPM培養(yǎng)基附加1.5mg·L-12，4-D和0.75mg·L-1KT，在光照條件下培養(yǎng)；不定芽生根和繼代生根時(shí)，均采

3、用WPM培養(yǎng)基附加一定量的IBA，在光照條件下培養(yǎng)。在這些培養(yǎng)基上外植體的分化率、誘導(dǎo)愈傷率以及生根率均達(dá)到了100％，而且生長狀況優(yōu)良。 確定了篩選歐美楊108轉(zhuǎn)化體及選擇生根培養(yǎng)時(shí)的抗生素濃度。潮霉素抑制葉片分化的濃度為2mg·L-1；生根培養(yǎng)時(shí)的選擇濃度為0～2mg·L～。比較了頭孢唑啉鈉和羧卞青霉素抑菌效果及對(duì)葉片分化和苗木生根的影響，結(jié)果表明頭孢唑啉鈉和羧卞青霉素濃度分另4為600mg·L-1和400mg·L-1時(shí)，可

4、完全抑制農(nóng)桿菌LBA4404的生長；在此濃度下，頭孢唑啉鈉對(duì)葉片的分化影響較羧卞青霉素大，而對(duì)苗木的生根影響較羧卞青霉素小。因此，在葉片分化時(shí)，采用400mg·L-1的羧卞青霉素抑菌；在生根時(shí)，采用600mg·L-1的頭孢唑啉鈉抑菌。 最后，探討了影響遺傳轉(zhuǎn)化的主要因素，首次建立了以潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)為選擇標(biāo)記基因的歐美楊108的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化歐美楊108葉片外植體，共得到18個(gè)潮霉素抗性愈傷和抗