水稻蛋白質(zhì)芯片的設(shè)計(jì)、構(gòu)建及初步驗(yàn)證.pdf

1、水稻是世界上最重要的糧食作物之一，是研究作物產(chǎn)量、轉(zhuǎn)基因、雜種優(yōu)勢(shì)、植物病蟲害抗性和其它抗逆等方面的重要遺傳材料，也是基礎(chǔ)研究的模式植物之一。水稻的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程幾乎都與蛋白激酶引起的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程有關(guān)，研究激酶尤其是其磷酸化過(guò)程和篩選其下游底物，了解植物發(fā)育調(diào)控機(jī)理尤其是抗逆機(jī)理，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的意義。 本試驗(yàn)建立了一種基于Pooling系統(tǒng)的水稻蛋白質(zhì)芯片的方法，每個(gè)樣品接取10個(gè)水稻根eDNA庫(kù)克隆，誘導(dǎo)表達(dá)后，用溶菌酶高

2、通量地裂解提取蛋白質(zhì)，總共提取了60板(96孔板)來(lái)自于水稻cDNA庫(kù)表達(dá)的β-gal融合蛋白質(zhì)，共6000個(gè)樣品，大約涵蓋60000個(gè)克隆；再把所提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行l(wèi)O倍的Pooling，得到Pooling之后的蛋白質(zhì)樣品15板，所含樣品數(shù)為1200個(gè)。應(yīng)用Dotblotting的方法，檢測(cè)了所有混合蛋白質(zhì)的基本表達(dá)情況，另外表達(dá)了一板蛋白質(zhì)，包括57個(gè)GST-水稻蛋白激酶和4個(gè)MBP-水稻蛋白質(zhì)，將所有這76板蛋白質(zhì)點(diǎn)在同一張芯片上。

3、用Anti-β-gal和Anti-GST雜交芯片檢測(cè)芯片質(zhì)量，并利用該芯片對(duì)水稻蛋白激酶PI-D2進(jìn)行了作用底物初步篩選的研究。結(jié)果如下： 1．基于Pooling的方法，表達(dá)了大約60000個(gè)水稻根cDNA克隆的蛋白質(zhì)。 2．利用溶菌酶裂解的方法，方便地同時(shí)提取多個(gè)蛋白質(zhì)，滿足了構(gòu)建水稻蛋白質(zhì)庫(kù)需大量提取蛋白質(zhì)的需要。 3．用Dot blotting方法檢測(cè)了基于Pooling系統(tǒng)提取的水稻庫(kù)混合蛋白質(zhì)的表達(dá)情況

4、，結(jié)果表明，蛋白質(zhì)庫(kù)質(zhì)量的表達(dá)水平能夠用來(lái)點(diǎn)制水稻蛋白芯片。 4．制備了含有7271個(gè)蛋白質(zhì)樣品的水稻蛋白質(zhì)芯片，并用Anti-β-gal和Anti-GST抗體對(duì)水稻蛋白質(zhì)芯片進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，結(jié)果說(shuō)明蛋白芯片質(zhì)量較好。 5．用該水稻蛋白質(zhì)芯片，進(jìn)行了水稻蛋白激酶PI-D2作用底物初步篩選的研究，獲得了一些可能的候選底物。 基于Pooling構(gòu)建的水稻蛋白質(zhì)芯片，減少了工作量，節(jié)約了成本和試劑用量。該芯片可能具有多種