2010年登革病毒流行株型別鑒定及DENV-4毒株全基因組序列分析.pdf

1、登革熱是通過伊蚊傳播的一種急性傳染性疾病。按血清型別分類，DENV有四個(gè)血清型，分別為DENV-1、DENV-2、DENV-3及DENV-4。登革熱在全球的主要流行區(qū)域?yàn)闊釒?、亞熱帶地區(qū)。全世界范圍內(nèi)，有一百多個(gè)國(guó)家出現(xiàn)過登革熱流行，約有25億人的健康受到登革熱威脅，每年新發(fā)感染病例上億人，當(dāng)中需要住院治療的重癥患者約50萬(wàn)，約有2.5萬(wàn)死亡病例。而我國(guó)，登革熱主要流行于南方沿海地區(qū)，以廣東的登革熱疫情最為嚴(yán)峻。在廣東，近乎每年均有病例

2、報(bào)道，而且四種登革病毒均有過流行，其中廣州是登革熱的高發(fā)病率城市。自1995年以來(lái)，DENV-1為廣東登革熱主要流行毒株，但是2009年發(fā)生了DENV-3流行，說(shuō)明近年來(lái)流行于其他國(guó)家和地區(qū)特別是東南亞地區(qū)其他血清型別的登革病毒有向廣東省輸入的趨勢(shì)。由此，關(guān)注臨床登革熱病例特點(diǎn)、分離登革病毒株并分析其病原學(xué)特征，對(duì)于全面闡述廣東登革熱疫情的流行趨勢(shì)及特征、病原體的來(lái)源和登革熱防治等都具有重大意義。
　　研究對(duì)象：
　　廣東省

3、廣州市第八人民醫(yī)院2010年8～12月間收治的登革熱病例。
　　研究目的：
　　對(duì)2010年8～12月流行的登革病毒株進(jìn)行血清型別鑒定，對(duì)培養(yǎng)分離新獲得的登革病毒株全基因組序列，進(jìn)行進(jìn)化樹分析，了解2010年登革流行病例的病原體及其基因組特點(diǎn)，以明確廣州登革熱的分子流行病學(xué)特點(diǎn)。
　　研究方法：
　　1.收集47例登革熱患者的病例資料，檢測(cè)47例登革熱患者急性期和恢復(fù)期的血清登革IgM及IgG抗體。
　　2

4、.提取早期血清中病毒RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，nest-PCR擴(kuò)增C-prM區(qū)，PCR產(chǎn)物測(cè)序后進(jìn)行DNA序列比對(duì)分析，確定登革病毒的血清型。
　　3.用C6/36細(xì)胞培養(yǎng)分離一名DENV-4感染患者的急性早期血清中的登革病毒。
　　4.使用PCR DESIGN及DNAclub軟件，設(shè)計(jì)擴(kuò)增登革病毒全基因組序列的10對(duì)PCR引物，通過RT-PCR擴(kuò)增后進(jìn)行基因序列測(cè)定，同時(shí)利用生物信息學(xué)相關(guān)知識(shí)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。
　

5、　研究結(jié)果：
　　1.47例登革熱病例中，輸入病例占12.8％，其余81.2%的病例為本地流行病例，結(jié)合患者的臨床、實(shí)驗(yàn)室資料，及登革病毒特異性抗體檢測(cè)結(jié)果（47例患者急性期IgM均為陽(yáng)性、IgG陰性；恢復(fù)期IgM均為陰性、IgG陽(yáng)性），均為登革熱確診病例。
　　2.20例患者 PCR陽(yáng)性，經(jīng)電泳分析PCR產(chǎn)物后，14例出現(xiàn)大小為392bp的特異性片段，6例擴(kuò)增出119bp大小的片段。經(jīng)測(cè)序鑒定PCR產(chǎn)物進(jìn)一步證實(shí)分別為DE

6、NV-4和DENV-2感染，前者全是本地感染病例，后者有輸入病例（2例）及本地病例（4例，均發(fā)生在輸入病例之后）。
　　3.用C6/36細(xì)胞成功從其中1名DENV-4患者急性期的早期血清中分離出登革病毒株，經(jīng)全基因組序列測(cè)定，廣州DENV-4株全長(zhǎng)10631bp，構(gòu)建進(jìn)化樹后分析證實(shí)此病毒株為登革4型病毒基因亞型Ⅱ毒株,與印度尼西亞的病毒株同源性最高。
　　4.與目前我國(guó)最早于1978年分離出的登革4型病毒基因亞型Ⅱ毒株相比