白菜花粉發(fā)育相關(guān)的C2H2型鋅指蛋白新基因BcMF20的克隆與功能驗(yàn)證.pdf

1、選育雄性不育系是作物雜種優(yōu)勢(shì)利用中簡(jiǎn)化制種程序、降低制種成本的重要手段，而十字花科作物生產(chǎn)一代雜種的理想系統(tǒng)是雄性不育系，花粉敗育是植物雄性不育發(fā)生的表型體現(xiàn)，弄清花粉發(fā)育的分子機(jī)理是研究雄性不育的關(guān)鍵所在。本實(shí)驗(yàn)室在成功構(gòu)建了三種共享同一保持系(核不育兩用系的可育株系)的白菜(Brassica campestris L.ssp.chinensis Makino，syn.B.rapa ssp.chinensis)‘矮腳黃’核不育(‘Ai

2、jiaohuang’genic male sterility，ajhGMS)兩用系‘Bcajh97-01A/B’、‘Polima’核質(zhì)互作不育(polima genic-cytoplasmic male sterility，polG-CMS)系‘Bcpol97-05A’以及‘Ogura’細(xì)胞質(zhì)不育(Ogura cytoplasmic male sterility，oguCMS)系‘Bcogu97-06A’材料體系的基礎(chǔ)上，采用擬南芥基因

3、芯片分析其花蕾轉(zhuǎn)錄組差異，對(duì)花粉基因表達(dá)譜進(jìn)行系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)在三種不育系花蕾中均下調(diào)表達(dá)的基因有29個(gè)，在這29條基因中，大部分(14條)是功能未知基因，僅有2條是轉(zhuǎn)錄因子。其中一條的轉(zhuǎn)錄本標(biāo)簽是At1＃6610，這是一條C2H2鋅指家族的轉(zhuǎn)錄因子。At1＃6610在三種不同雄性不育遺傳模式的材料中表達(dá)均下調(diào)，提示我們它可能與花粉發(fā)育相關(guān)。本研究通過(guò)同源克隆的方法獲得白菜中At1g26610的同源基因的編碼序列和DNA全長(zhǎng)，分析其序列特

4、征；克隆其在十字花科蕓薹屬和蘿卜屬的18份材料中的同源基因，同時(shí)通過(guò)與近緣基因的比較，構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)，探討進(jìn)化關(guān)系；運(yùn)用半定量PCR和實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)分析該基因在‘Bcajh97-01A/B’不育株和可育株花蕾五級(jí)、花序、嫩角果、花莖和花葉中的表達(dá)情況，同時(shí)采用原位雜交方法分析其在組織中的定位，明確其時(shí)空表達(dá)情況；最后運(yùn)用反義RNA技術(shù)，對(duì)擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得這個(gè)基因的功能缺失突變體，鑒別該基因在花粉發(fā)育過(guò)程中的作用。取得的主要結(jié)

5、果如下：
　　 (1)依據(jù)擬南芥At1g26610序列，采用同源克隆方法擴(kuò)增獲得在可育株‘Bcajh97-01B’中高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本標(biāo)簽At1g26610在白菜中的同源基因，對(duì)該基因的cDNA序列和DNA序列分析可知，該基因最大開(kāi)放閱讀框?yàn)?359 bp，無(wú)內(nèi)含子和外顯子，Blast搜索沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相同序列的基因，說(shuō)明這是一條新基因，我們將其命名為BcMF20(Brassica campestris male fertility ge

6、ne20)。對(duì)推導(dǎo)的BcMF20編碼氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能域的分析表明，BcMF20編碼452個(gè)氨基酸。編碼的假定蛋白質(zhì)的分子量為50.874 kDa，等電點(diǎn)為8.562，pH7.0時(shí)的電荷為12.241，包含堿性氨基酸(K，R)72個(gè)，酸性氨基酸(D，E)63個(gè)，疏水氨基酸(A，I，L，F(xiàn)，W，V)105個(gè)，極性氨基酸(N，C，Q，S，T，Y)133個(gè)。BcMF20基因是MMB型的3鋅指C2H2鋅指家族轉(zhuǎn)錄因子，其結(jié)構(gòu)與矮牽牛EPF

7、家族的TAZ1(ZPT3-2)基因的相似程度較高。
　　 (2)根據(jù)BcMF20的全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物，在十字花科蕓薹屬和蘿卜屬的18個(gè)物種中克隆到BcMF20的同源序列，對(duì)十字花科植物BcMF20同源基因DNA序列進(jìn)行核苷酸同源序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)BcMF20同源基因在DNA序列上的相似性為86.9％～100％。所有基因均沒(méi)有內(nèi)含子，尤其是在CDS的起始區(qū)和終止區(qū)，序列完全相同。它們所編碼的蛋白質(zhì)同源性高達(dá)77.6％～100％，均是3個(gè)

8、鋅指的C2H2轉(zhuǎn)錄因子，且編碼的鋅指類型與BcMF20一致，均為MMB型。在鋅指的保守區(qū)域，堿基序列完全相同。在NCBI上對(duì)BcMF20.進(jìn)行BLAST搜索查詢，發(fā)現(xiàn)12個(gè)與BcMF20有較高相似性的C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子，NJ法構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)，結(jié)果顯示BcMF20與同科的擬南芥的三條C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子聚成一類，然后再與矮牽牛中的兩條C2H2的4鋅指C2H2轉(zhuǎn)錄因子聚為一類。
　　 (3)采用半定量PCR和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析Bc

9、MF20在‘Bcajh97-01A/B’不育株和可育株花蕾五級(jí)、花序、嫩角果、花莖和花葉中的表達(dá)情況，半定量PCR結(jié)果顯示BcMF20基因僅在可育系Ⅳ級(jí)、Ⅴ級(jí)花蕾中有表達(dá)，說(shuō)明BcMF20基因可能與花粉發(fā)育相關(guān)；實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明BcMF20在不育系‘Bajh97-01A’中的表達(dá)量極低，BcMF20基因在花蕾Ⅰ級(jí)-Ⅴ級(jí)以及開(kāi)放的花中表達(dá)，在角果、花莖、花葉中無(wú)表達(dá)，并且BcMF20基因在可育系Ⅳ級(jí)、Ⅴ級(jí)花蕾中表達(dá)量非常大，實(shí)時(shí)定量

10、PCR的結(jié)果證明該基因確實(shí)與花粉發(fā)育有關(guān)，按照Mascarenhas(1990)對(duì)花粉表達(dá)基因的分類方法，應(yīng)該被歸于“晚期”基因。原位雜交分析發(fā)現(xiàn)雜交信號(hào)出現(xiàn)在單核小孢子時(shí)期的小孢子和絨氈層細(xì)胞中，在花粉成熟早期的小孢子和將要降解的絨氈層細(xì)胞中繼續(xù)表達(dá)，提示我們BcMF20可能在單核小孢子時(shí)期對(duì)絨氈層和花粉發(fā)育起作用。
　　 (4)構(gòu)建含有組成型啟動(dòng)子CaMV35S的RNA反義載體，并利用Floral Dip法將構(gòu)建的反義載體導(dǎo)

11、入擬南芥中，與空載體對(duì)照比較，轉(zhuǎn)基因植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)正常，雌蕊正常，花藥上花粉量少，最終不能形成正常飽滿果莢。轉(zhuǎn)基因擬南芥花粉不萌發(fā)，T1代萌發(fā)率為13％，T2代為15％。掃描電鏡顯示，82％的轉(zhuǎn)基因植株的花粉畸形。與正常的橢圓形、三條萌發(fā)溝均勻分布的花粉粒相比，轉(zhuǎn)基因植株的花粉呈現(xiàn)各種空洞，凹陷，異?？瞻T。透射電鏡顯示導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株花粉萌發(fā)率降低的主要原因有兩個(gè)：一是花藥內(nèi)花粉數(shù)量減少，二是花粉畸形、空泡化。轉(zhuǎn)基因植株的花粉畸形是由于花粉