白菜花粉發(fā)育相關(guān)的PGIP新基因BcMF19的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、盡管利用農(nóng)作物雜種優(yōu)勢生產(chǎn)雜交種子的途徑很多,但以利用雄性不育性育成不育系生產(chǎn)雜種是最為經(jīng)濟(jì)、有效的途經(jīng)。蕓薹屬作物作為雜交優(yōu)勢利用最為普遍的一類作物,創(chuàng)建雄性不育系是生產(chǎn)一代雜種的理想方法?；ǚ郯l(fā)育相關(guān)基因的分離和基因功能分析,為深入探索白菜類等蕓薹屬作物花粉發(fā)育的分子機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),也同樣能通過運(yùn)用反義或者干涉技術(shù)等抑制花粉發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)而獲得雄性不育植株,進(jìn)而用于生產(chǎn)。但是,有效地控制育性的基礎(chǔ)還在于對花粉發(fā)育相關(guān)的一系列

2、基因及其功能的充分認(rèn)識。本研究的依據(jù)是白菜(Brassica campestris ssp.chinensis)核隱性不育兩用系‘Bcajh97-01A/B’中分離得到一個(gè)在不育和可育株花蕾中差異表達(dá)的擴(kuò)增互補(bǔ)脫氧核糖核酸片段長度多態(tài)性(cDNA-amplified fragment length polymorphism,cDNA-AFLP)片段,NCBI的比對結(jié)果發(fā)現(xiàn),該片段具有多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturon

3、ase inhibitory protein,PGIP)基因的特征。為了認(rèn)識該片段基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)特征,為進(jìn)一步研究其功能打下基礎(chǔ),本研究利用cDNA末端快速擴(kuò)增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技術(shù)和同源基因擴(kuò)增的方法克隆基因全長,分析其序列特征并預(yù)測其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能,進(jìn)而采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time polymerase chainreaction,RT-PCR)分析其

4、在可育株和不育株的不同發(fā)育階段的花蕾中和營養(yǎng)器官中的表達(dá)情況,采用組織原位雜交進(jìn)行該基因的細(xì)胞定位,預(yù)測其與花粉發(fā)育的關(guān)系。取得的主要結(jié)果如下:(1)從白菜核隱性不育兩用系‘Bcajh97-01A/B’可育株中分離得到的一個(gè)cDNA-AFLP差異片段入手,利用RACE技術(shù)和同源基因擴(kuò)增的方法成功克隆出一條在正?？捎昊ɡ僦懈弑磉_(dá)的PGIP基因的cDNA全長,命名為白菜雄性可育基因19(Brassica campestris Male F

5、ertility19,BcMF19),該序列已被遞交到GeneBank數(shù)據(jù)庫,登錄號為:GQ902048。用同源克隆的方法得到1136堿基對(base pair,bp)的BcMF19的DNA全長序列。BcMF19包含兩個(gè)外顯子(605 bp和373 bp)和一個(gè)內(nèi)含子(158 bp),外顯子和內(nèi)含子交接處序列遵循GT-AG規(guī)律,是典型的剪接體識別序列。該基因的最大開放閱讀框(Openreadinz frame,ORF)為978 bp,編

6、碼325個(gè)氨基酸。BcMF19二級結(jié)構(gòu)包含27.38％的α螺旋,15.08%的β折疊和57.54%的環(huán)狀結(jié)構(gòu),并含有一個(gè)保守的疏水區(qū)和一個(gè)跨膜螺旋區(qū),而且該蛋白包含10個(gè)富亮氨酸重復(fù)序列(Leucine-rich repeat,LRR),1個(gè)信號肽和3個(gè)N-糖基化位點(diǎn),N端和C端分別有半胱氨酸的二硫鍵形成區(qū),與PGIP的典型二級結(jié)構(gòu)一致。BcMF19的三級結(jié)構(gòu)是一個(gè)β-片層(LxxLxLxxN/CxL)和一個(gè)α-螺旋通過loop環(huán)連接形

7、成,相鄰的多個(gè)LRR通常圍繞共同的軸平行排列,形成一個(gè)卷曲的馬蹄形結(jié)構(gòu),與PGIP的典型三級結(jié)構(gòu)一致。這些結(jié)果表明BcMF19具有PGIP的基本特征,可能屬于PGIP家族中的一員。(2)使用DNAStar軟件中的MegAlign程序,對十字花科蕓薹屬和蘿卜屬17份材料的BcMF19同源基因DNA序列進(jìn)行核苷酸同源序列比對,發(fā)現(xiàn)BcMF19同源基因在DNA序列上的相似性為97.3%~100%,這說明不同物種中BcMF19同源基因保守,分化

8、后堿基的替代事件發(fā)生較少。蕓薹屬中的普通白菜與“大頭1”蕪菁甘藍(lán)、黑芥與“雪里蕻”分蘗菜和普通白菜與“馬耳頭”分蘗菜DNA的相似性都達(dá)到了99.9%。但是其中埃塞俄比亞芥與“黃芽14”大白菜的DNA相似性最低,為97.3%。而黑芥和櫻葉蘿卜的DNA的相似度達(dá)到100%。BcMF19與其他物種的48個(gè)PGIP比對發(fā)現(xiàn),其N末端除了半胱氨酸殘基部分與十字花科相似性較高,其他部分就存在一定的差異,并且BcMF19與其他十字花科PGIP的LRR

9、的保守區(qū)一致,但非保守序列幾乎沒有相似性。NJ法構(gòu)建的進(jìn)化樹結(jié)果為BcMF19與十字花科植物的PGIP不聚為一類,推測BcMF19是十字花科PGIP基因在進(jìn)化中的又一分支。(3)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和原位雜交技術(shù)分析BcMF19的時(shí)空表達(dá)表明,該基因在可育株五級花蕾中的表達(dá)量是明顯上調(diào)的,尤其在花粉減數(shù)分裂期、四分體時(shí)期和成熟花粉粒時(shí)期,說明BcMF19與花粉發(fā)育相關(guān)。而且該基因在可育株和不育株的花莖和花葉中表達(dá)量也有