牛副流感病毒3型弱毒株對豚鼠的免疫原性研究及其致弱的分子基礎(chǔ).pdf

1、牛副流感(Bovine parainfluenza)是由牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type3，BPIV3)引起的一種急性接觸性傳染病，曾被稱為“船運熱”(Shipping fever)。發(fā)病牛食欲不振，精神萎靡，有流涕、流淚和咳嗽等呼吸道病癥狀，個別牛體溫升高，表現(xiàn)嚴(yán)重的牛發(fā)生呼吸困難。在運輸和寒冷等應(yīng)激情況下可繼發(fā)細(xì)菌或支原體感染，如多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌、牛支原體等，從而引起嚴(yán)重

2、的支氣管肺炎，導(dǎo)致牛呼吸道疾病綜合征(Bovinerespiratory disease complex，BRDC)，使死亡率大大增加。BRDC在全球范圍內(nèi)對養(yǎng)牛業(yè)造成極大的危害，給養(yǎng)牛業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。病原學(xué)診斷和血清流行病學(xué)檢測均顯示BPIV3感染在我國流行較廣，因此我國目前迫切需要研發(fā)有效的BPIV3疫苗，以便對BPIV3感染實施有效的防控。
　　本研究將BPIV3 SD0835株在細(xì)胞上進(jìn)行多次傳代，評估高代次病毒對豚

3、鼠致病性，篩選可以作為弱毒疫苗的候選毒株。首先將分離到的野毒SD0835株在MDBK細(xì)胞中進(jìn)行傳代，連續(xù)進(jìn)行了207次，以期達(dá)到降低其致病性的目的。我們選擇了3個高代次的病毒(P126、P151和P208)，研究它們對豚鼠的致病性，和野毒BPIV3 P2進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，高代次病毒對豚鼠的致病性降低，主要表現(xiàn)為高代次病毒感染豚鼠后導(dǎo)致動物發(fā)熱的數(shù)量減少，在肺臟中復(fù)制的滴度顯著下降，也不會導(dǎo)致肺臟出現(xiàn)顯著的眼觀病變，而且都可以誘導(dǎo)豚鼠產(chǎn)

4、生一定滴度的中和抗體。病理學(xué)組織觀察顯示P126和P151組豚鼠肺臟呈現(xiàn)肺泡間隔增寬等病變，和野毒組豚鼠肺臟病變非常相似。值得注意的是，P208代次毒感染豚鼠后沒有導(dǎo)致其死亡，肺臟病毒滴度減少，尤其是病理結(jié)果顯示該組豚鼠肺臟組織病理學(xué)病變程度與其他代次毒感染組相比減少很多，有的豚鼠肺臟沒有病變，接近空白對照組。綜合上述實驗獲得的結(jié)果，可以初步確定BPIV3 P208代次毒通過鼻內(nèi)感染對于豚鼠是安全的，并且可以誘導(dǎo)其產(chǎn)生病毒中和抗體，該毒

5、株可以作為弱毒疫苗的候選毒株，因此后期可以將該毒株在本動物牛上進(jìn)行免疫和攻毒實驗，以驗證其安全和有效性。
　　目前我國還沒有相關(guān)的BPIV3疫苗研究和商品化的疫苗。之前的研究已經(jīng)表明，BPIV3經(jīng)過細(xì)胞傳代后，其對豚鼠的致病性是顯著降低的，而且可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體。因此我們將BPIV3 P208作為弱毒疫苗候選株，免疫豚鼠后攻毒，評價其安全性和有效性。結(jié)果顯示肌肉注射免疫豚鼠后，豚鼠直腸溫度正常也沒有產(chǎn)生任何臨床癥狀，說明該弱

6、毒疫苗株有較好的安全性;經(jīng)過加強免疫后，豚鼠產(chǎn)生了高滴度的中和抗體，而且CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的比例上升。攻毒后免疫的豚鼠沒有死亡的現(xiàn)象，呼吸道中幾乎分離不到病毒;而未免疫組的豚鼠有死亡的現(xiàn)象，呼吸道中病毒滴度較高，這說明該疫苗可以有效保護(hù)豚鼠免受強毒的攻擊。攻毒后我們也檢測了CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的比例，發(fā)現(xiàn)免疫組和空白對照組豚鼠都出現(xiàn)不同比例的下降，空白對照組下降的比鍘更大。總之，BPIV3的P208代次毒作為一個弱毒疫

7、苗候選株具有較大的應(yīng)用前景和價值。
　　BPIV3通過細(xì)胞傳代后，其致病性降低，然而相關(guān)的分子基礎(chǔ)尚不清楚。我們測定了BPIV3 P2和數(shù)株高代次病毒的F和HN基因序列，測序結(jié)果顯示F和HN基因一共發(fā)生了14個有義突變，導(dǎo)致相應(yīng)的14個氨基酸的改變，這些突變可能與BPIV3細(xì)胞傳代毒的致病性降低有關(guān)。而想要鑒定這些突變和毒力致弱的關(guān)系，構(gòu)建病毒的感染性克隆是必不可少的。本研究將BPIV3分為7個節(jié)段，分別通過人工合成和RT-PCR

8、的方法獲得，通過合適的酶切位點進(jìn)行拼接，構(gòu)建了BPIV3全長基因組。同時也構(gòu)建了表達(dá)核蛋白、磷蛋白和聚合酶蛋白的輔助質(zhì)粒，免疫熒光顯示這些輔助質(zhì)粒都能在哺乳類動物細(xì)胞中表達(dá)。將BPIV3全長基因組cDNA和3個輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞，進(jìn)行了病毒的拯救，但現(xiàn)階段尚未拯救成功。
　　綜上所述，BPIV3經(jīng)過207次細(xì)胞傳代之后，高代次病毒在細(xì)胞上繁殖能力和親本毒株相當(dāng)。致病性實驗結(jié)果表明，高代次病毒尤其是P208毒株對豚鼠的致病力

9、顯著下降，主要表現(xiàn)在不會導(dǎo)致豚鼠死亡、病毒在肺臟中復(fù)制滴度減少、肺臟無眼觀病變、肺臟病理組織學(xué)變化也顯著減少，同時病毒仍然可以誘導(dǎo)動物產(chǎn)生中和性抗體，說明BPIV3 P208株可以作為疫苗候選株。將該疫苗候選株肌肉注射豚鼠，豚鼠沒有表現(xiàn)出任何臨床癥狀也沒有病毒血癥的發(fā)生，說明該疫苗株是安全的。該疫苗可以誘導(dǎo)動物機體產(chǎn)生體液免疫，還可以刺激淋巴細(xì)胞增殖。攻毒實驗表明免疫后的豚鼠可以抵抗親本毒的感染，表現(xiàn)在免疫組豚鼠沒有死亡，肺臟和氣管病毒