鴨坦布蘇病毒誘導(dǎo)的宿主天然免疫反應(yīng)及與RLR信號(hào)通路的互作研究.pdf

1、鴨坦布蘇病毒（duck Tembusu virus,DTMUV）是一種有囊膜的，單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科黃病毒屬。DTMUV于2010年首先在福建、浙江等地的發(fā)病鴨場(chǎng)中分離到，主要引起產(chǎn)蛋鴨群產(chǎn)蛋下降、商品肉鴨生長(zhǎng)遲緩和神經(jīng)癥狀。該病傳播迅速，給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　宿主天然免疫反應(yīng)在病原微生物感染早期發(fā)揮重要作用，模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors,PRRs）作為宿主

2、天然免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成元件，主要識(shí)別病原微生物的保守成分。RIG-I樣受體（RIG-I like receptor,RLR）是主要分布于非免疫細(xì)胞中的一類胞漿PRRs，包含維甲酸誘導(dǎo)基因I（retinoic acid induced gene-I,RIG-I）、黑色素瘤分化相關(guān)基因（melanoma differentiation associated gene5,MDA5）以及遺傳和生理學(xué)實(shí)驗(yàn)基因2（laboratory of gen

3、etics and physiology-2,LGP2），主要識(shí)別RNA病毒，通過接頭分子線粒體抗病毒信號(hào)蛋白（mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS），啟動(dòng)下游信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，合成一系列的細(xì)胞因子，如I型干擾素和炎性細(xì)胞因子等，使宿主建立抗病毒天然免疫狀態(tài)。目前，對(duì)DTMUV的致病性還不清楚，DTMUV感染后誘導(dǎo)的宿主天然免疫反應(yīng)以及RLR在病毒感染過程中的作用更是缺乏了解。本研究以

4、櫻桃谷雛鴨為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，通過病理組織學(xué)分析、熒光定量PCR等方法，首先觀察DTMUV對(duì)不同日齡櫻桃谷鴨的致病性差異，以及感染后誘導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)，然后使用過表達(dá)、RNA干擾和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)等方法對(duì)RIG-I、MDA5和MAVS在病毒感染過程中的作用進(jìn)行分析，初步探討了DTMUV對(duì)RLR信號(hào)通路的抑制作用。研究?jī)?nèi)容主要分為以下四個(gè)方面：
　　1.DTMUV對(duì)不同日齡櫻桃谷鴨的致病性研究
　　1、3和7周齡的櫻桃谷鴨通過腿

5、部肌肉注射途徑感染DTMUV，然后觀察感染鴨的臨床癥狀、病理組織學(xué)變化、組織含毒量以及血清中和抗體等變化規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1周齡雛鴨在感染后第2天出現(xiàn)明顯的以神經(jīng)紊亂為主的臨床癥狀，在感染后第5-7天，部分感染鴨死亡。3周齡感染鴨表現(xiàn)類似但程度較輕的臨床癥狀，且未見死亡。而7周齡感染鴨僅出現(xiàn)一過性的食欲減退。實(shí)驗(yàn)鴨主要組織的病變程度隨著感染日齡的增大而逐漸減輕。1周齡感染鴨出現(xiàn)明顯的心內(nèi)膜出血、脾腫大，回腸淋巴組織集中處黏膜腫脹，肝、腎腫

6、脹且有出血，腦膜充血。3周齡感染鴨的病變程度較輕微，7周齡鴨則未見明顯的眼觀病變。但是，病理組織學(xué)分析顯示，三組感染鴨均呈現(xiàn)典型的病毒性腦炎病變。組織中病毒含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，感染后第1天，DTMUV即能在1周齡感染鴨的大腦中檢測(cè)到，感染后第3-5天，1周齡鴨的主要組織含毒量均顯著高于另外兩組感染鴨對(duì)應(yīng)組織的含毒量（P＜0.05）。感染鴨血清中IFN-γ、IL-2及中和抗體的含量呈相似性變化，但1周齡鴨與另外兩組鴨存在顯著性差異（P＜0.05

7、）。更重要的是，盡管各組實(shí)驗(yàn)鴨的血清中和抗體在DTMUV感染后第7-19天無顯著差異，但是1周齡鴨的病毒清除速度卻顯著慢于3、7周齡鴨，表明與鴨日齡相關(guān)的自身免疫系統(tǒng)即天然免疫在感染早期清除病毒的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用?？偟膩碚f，本部分研究證實(shí)DTMUV對(duì)不同日齡鴨的致病性不同，日齡越小致病性越強(qiáng)，與日齡相關(guān)的免疫反應(yīng)能力對(duì)DTMUV的致病性具有重要影響。
　　2.DTMUV感染雛鴨和鴨胚成纖維細(xì)胞（DEFs）后誘導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)

8、r>　　為確定DTMUV感染后誘導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)，我們通過相對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)了病毒感染1周齡雛鴨脾和腦組織中天然免疫相關(guān)基因的變化。結(jié)果顯示，在DTMUV感染的早期階段，病毒能顯著上調(diào)RIG-I、MDA5和TLR3的表達(dá)（P＜0.05），說明這些PRRs參與DTMUV感染后誘導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)。同時(shí)，炎性細(xì)胞因子（IL-1β、L-2、IL-6和IL-8）和抗病毒蛋白（Mx、OAS等）也大量表達(dá)，其中IL-6表達(dá)量的增加最為顯著。在感染

9、鴨的脾和腦中，I型和II型IFNs的變化不同。在脾中，兩種類型IFNs均呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)，但是在腦中，二者變化趨勢(shì)差異較大。除此之外，我們還檢測(cè)了DTMUV體外感染DEFs后RIG-I、MDA5、I型IFNs和部分促炎細(xì)胞因子的表達(dá)變化，結(jié)果與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)類似，RIG-I和MDA5被病毒激活而過量表達(dá)，導(dǎo)致IFN-α和IFN-β、抗病毒蛋白OAS以及IL-6、IL-8等的大量表達(dá)。上述研究結(jié)果說明，DTMUV感染雛鴨和DEFs后其抗病毒天

10、然免疫反應(yīng)被迅速激活，但仍不足以抵抗病毒短時(shí)間內(nèi)快速、大量的增殖，同時(shí)，促炎細(xì)胞因子如IL-6等的大量產(chǎn)生亦能對(duì)宿主自身造成一定的免疫損傷，從而加重病情。
　　3.RIG-I和MDA5參與宿主的抗DTMUV感染
　　為了進(jìn)一步明確RIG-I和MDA5在抗DTMUV感染過程中的作用，使用過表達(dá)和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)等技術(shù)分析了病毒感染DEFs后二者介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生情況。首先通過前期的實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)DTMUV能誘導(dǎo)RIG

11、-I、MDA5、MAVS和IFN-β在mRNA水平上顯著上調(diào)。進(jìn)一步地，先在DEFs上分別過表達(dá)RIG-I和MDA5的全長(zhǎng)及其效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，再感染DTMUV，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)受體及其效應(yīng)結(jié)構(gòu)域均能抑制DTMUV增殖。繼而，我們克隆并表達(dá)了鴨MAVS基因（duMAVS），通過過表達(dá)和RNA干擾證實(shí)，duMAVS在DTMUV感染過程中是必須的。此外，DTMUV感染后能進(jìn)一步刺激RIG-I和MDA5誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和IRF-7的產(chǎn)量，說明過表達(dá)

12、的RIG-I和MDA5識(shí)別DTMUV核酸后能通過 NF-κB和 IRF-7信號(hào)通路激活下游IFN-β。本部分研究初步確定RIG-I/MDA5-MAVS-IRF-7/NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)IFN-β參與抗DTMUV的天然免疫反應(yīng)。
　　4.DTMUV的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1抑制RIG-I和MDA5介導(dǎo)的信號(hào)通路
　　前期發(fā)現(xiàn)預(yù)先感染了DTMUV的細(xì)胞，再次經(jīng)RIG-I或MDA5刺激后，其誘導(dǎo)的IFN-β表達(dá)量顯著低于對(duì)照組細(xì)胞，提示

13、DTMUV對(duì)RIG-I和MDA5介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生存在一定的抑制作用。為了進(jìn)一步明確DTMUV通過何種方式拮抗宿主IFN-β的產(chǎn)生，我們分別克隆并構(gòu)建了病毒7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5的真核表達(dá)質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)有NS1蛋白的細(xì)胞中IFN-β含量較對(duì)照組顯著下降，表明DTMUV的NS1蛋白在拮抗RIG-I和MDA5的信號(hào)通路中起主要作用。進(jìn)一步地，將NS1和duMAVS的真核表達(dá)質(zhì)