MDRV感染誘導(dǎo)宿主天然免疫反應(yīng)的機(jī)理研究.pdf

1、番鴨呼腸孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）是一種主要針對水禽的傳染性病毒，其臨床癥狀主要表現(xiàn)在肝、脾出現(xiàn)大量灰白或黃白色壞死點(diǎn)，該病毒給中國養(yǎng)禽業(yè)中造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　由于機(jī)體先天性免疫在防御病毒入侵中起到關(guān)鍵性的作用，人們越來越關(guān)注由病毒感染誘發(fā)的免疫應(yīng)答機(jī)制。因?yàn)槊庖邞?yīng)答是機(jī)體抵抗病毒入侵的第一道防線，所以有效地激活天然免疫應(yīng)答一方面能直接清除病毒的感染，另一方面能促進(jìn)抗病毒特異性免疫應(yīng)答反

2、應(yīng)的建立。因此，研究由病毒感染誘發(fā)的天然免疫應(yīng)答的調(diào)控機(jī)制具有重要意義。
　　本研究主要運(yùn)用 RNA干擾技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系 sh-RIG-I，sh-MDA5，sh-TLR3，sh-Visa，sh-NF-κB，sh-IRF-7和sh-IRF-3。通過PCR及Western Blot技術(shù)檢測干擾基因?qū)DRV感染誘導(dǎo)表達(dá)IFNs的影響；采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染VG-RNA，viral RNA或cellular RNA，檢測IFNs

3、及ISG15的表達(dá)情況；使用體外干擾素刺激，觀察其對MDRV復(fù)制的影響。得到以下結(jié)果：
　　（1）293T細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染病毒基因組RNA（VG-RNA），MDRV感染24 h后的總RNA（Viral RNA）和沒有感染MDRV的293T細(xì)胞RNA（Cellular RNA）4h，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染VG-RNA和Viral RNA的細(xì)胞，IFNs和ISG15的表達(dá)量顯著升高。
　?。?）MDRV感染sh-RIG-I、sh-MDA5及s

4、h-TLR3穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系后，與對照組相比（sh-Luciferase細(xì)胞系），干擾素的表達(dá)量顯著下降；MDRV感染干擾Visa基因穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系后，與對照組相比（sh-Luciferase細(xì)胞系），干擾素的表達(dá)受到顯著抑制；MDRV感染IRF-7和IRF-3表達(dá)沉默的293T穩(wěn)定細(xì)胞系后，與對照組相比（sh-Luciferase細(xì)胞系），sh-IRF-7穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系中 IFN-β的表達(dá)量沒有明顯變化，IL-28A/B和IL-29表

5、達(dá)量明顯降低；在sh-IRF-3穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系中，干擾素表達(dá)沒有明顯變化；NF-κB抑制劑 Bay預(yù)處理細(xì)胞2 h后，接種MDRV，與對照組相比（DMSO預(yù)處理細(xì)胞2 h），干擾素的表達(dá)受到顯著的抑制。
　?。?）體外合成干擾素預(yù)處理細(xì)胞不同時(shí)間（0 h、3 h、6 h、12 h）后，接種MDRV，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MDRV復(fù)制量顯著下降。
　　（4）MDRV感染番鴨不同時(shí)間點(diǎn)后，檢測機(jī)體上RIG-I，MDA5，TLR3和I型干擾素表