TRIM14調(diào)控天然免疫反應(yīng)機(jī)制研究.pdf

1、TRIM14(tripartite motif-containing14)是TRIM家族的蛋白，含有B-box、coiled-coil和PRYSPRY結(jié)構(gòu)域。前期通過siRNA文庫篩選發(fā)現(xiàn)TRIM14在病毒引起的宿主天然免疫反應(yīng)中具有調(diào)控功能。進(jìn)一步研究表明TRIM14定位于線粒體外膜，通過C-末端PRYSPRY結(jié)構(gòu)域與RLRs（RIG-Ⅰ like receptors）信號通路中的線粒體接頭分子MAVS(mitochondria an

2、tiviral signaling)相互作用，并與天然免疫調(diào)節(jié)因子NEMO(NF-κB essential modulator)蛋白直接相互作用。但是，TRIM14通過與NEMO及MAVS的相互作用調(diào)控天然免疫反應(yīng)的分子機(jī)制仍不明確。另外，由于天然免疫分子的活化必須受到嚴(yán)格調(diào)控以防止過度炎癥反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體損傷，我們推測TRIM14的活性也受到調(diào)控。鑒于此，我們深入分析了TRIM14對線粒體天然免疫的調(diào)控機(jī)制，并對TRIM14自身活性的調(diào)控

3、機(jī)制進(jìn)行了研究。本研究將為闡明抗病毒天然免疫反應(yīng)機(jī)制提供依據(jù)。
　　本研究首先對TRIM14與NEMO相互作用的具體機(jī)制及功能進(jìn)行深入分析，以闡明TRIM14調(diào)控線粒體天然免疫的分子機(jī)制。通過定點突變發(fā)現(xiàn)泛素鏈感受蛋白NEMO的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域NUB(NEMO ubiquitin-binding)和ZF(zinc finger)結(jié)構(gòu)域是與TRIM14的結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，刪除NUB和ZF結(jié)構(gòu)域嚴(yán)重影響NEMO與TRIM14的結(jié)合以及Ⅰ

4、型干擾素的表達(dá)。同時，SeV感染細(xì)胞后，TRIM14發(fā)生K63泛素化。突變分析表明，TRIM14 K365位點是K63泛素化的關(guān)鍵位點，該位點突變后，TRIM14與NEMO的結(jié)合能力及誘導(dǎo)干擾素啟動子活性的能力都下降。上述結(jié)果表明TRIM14通過結(jié)合的泛素化鏈與NEMO相互作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，SeV感染后MAVS與NEMO相互結(jié)合，并在感染6小時時達(dá)到高峰，過表達(dá)TRIM14促進(jìn)NEMO與MAVS之間的相互作用，而在THP1細(xì)胞中敲

5、低TRIM14后，病毒誘導(dǎo)的NMEO與MAVS的結(jié)合減弱，同時NEMO轉(zhuǎn)移至線粒體的過程受到抑制。以上結(jié)果提示TRIM14在病毒感染后發(fā)生泛素化并通過泛素鏈招募NEMO到線粒體上促進(jìn)MAVS信號小體的組裝，該研究結(jié)果闡釋了TRIM14介導(dǎo)線粒體抗病毒天然免疫反應(yīng)的機(jī)制。
　　為深入研究TRIM14自身活性調(diào)控機(jī)制，結(jié)合TRIM14在病毒感染過程中受到泛素化調(diào)控這一現(xiàn)象，我們對RLRs信號通路相關(guān)的E3泛素連接酶進(jìn)行篩選，結(jié)果表明E

6、3泛素連接酶RNF125過表達(dá)增強TRIM14泛素化水平。免疫熒光共聚焦顯示過表達(dá)的RNF125和TRIM14，共定位于線粒體。免疫共沉淀結(jié)果證明RNF125通過RING結(jié)構(gòu)域與TRIM14相互作用。進(jìn)一步研究表明，RNF125通過蛋白酶體途徑降解TRIM14?；谏鲜霈F(xiàn)象，我們推測RNF125有可能是TRIM14的E3泛素連接酶。突變實驗證明，刪除RNF125的RING結(jié)構(gòu)域或者突變其泛素連接酶活性位點C72/75導(dǎo)致RNF125喪失

7、促進(jìn)TRIM14的泛素化。同時，體外酶促反應(yīng)實驗也進(jìn)一步證實RNF125是TRIM14的E3泛素連接酶。敲除RNF125的小鼠成纖維細(xì)胞(MEF)細(xì)胞在干擾素處理后，TRIM14的表達(dá)量持續(xù)增加，而野生型MEF細(xì)胞中TRIM14表達(dá)量在后期下降。另外，RNF125過表達(dá)抑制TRIM14激活Ⅰ型干擾素和NF-κ B啟動子的功能，反之，敲低RNF125，則促進(jìn)TRIM14的功能。以上實驗表明RNF125對TRIM14具有負(fù)調(diào)控功能。