Toll樣受體在豬細(xì)小病毒誘導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)中的作用研究.pdf

1、豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus,PPV）屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬，是無囊膜的DNA病毒。PPV病毒感染能夠引起母豬繁殖障礙性疾病，造成母豬流產(chǎn)、胎兒畸形、木乃伊化及死亡等，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成巨大危害。PPV在大多數(shù)豬原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞上均能增殖，并使細(xì)胞發(fā)生明顯病變，常作為模式病毒來探究病毒的感染機(jī)制和藥物的抗病毒機(jī)制。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor kappaB，NF-

2、κB）是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控多種炎性細(xì)胞因子、趨化因子等的轉(zhuǎn)錄，Toll樣受體（Toll-like receptors,TLRs）能夠通過MyD88(Myeloid differentiation factor88)依賴途徑和MyD88非依賴途徑誘導(dǎo)NF-κB和TRAF6（TNF receptor associated factor-6）等基因活化，引起相關(guān)炎性細(xì)胞因子、趨化因子及干擾素等的合成與釋放，并在免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮

3、重要作用。本研究用豬腎傳代細(xì)胞（PK-15）作為細(xì)胞模型，首先研究了PPV感染細(xì)胞后TLR1-10的表達(dá)情況，然后研究了PPV感染PK-15細(xì)胞對(duì)NF-κB信號(hào)通路和免疫應(yīng)答的影響，最后對(duì)TLR9在PPV感染細(xì)胞激活NF-κB信號(hào)通路中的功能進(jìn)行研究，明確了TLRs在PPV感染PK-15細(xì)胞后誘導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)中的作用。研究?jī)?nèi)容如下：
　　1.根據(jù)GenBank中豬TLR1~10基因序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR特異性引物，并檢測(cè)PPV感

4、染PK-15細(xì)胞后TLR1~10的轉(zhuǎn)錄規(guī)律。結(jié)果顯示，PPV感染PK-15細(xì)胞后，TLR1在PPV感染后3h表達(dá)上調(diào)，約為對(duì)照細(xì)胞的3.1倍，其他時(shí)段均低于正常水平；TLR3和TLR7mRNA表達(dá)水平在病毒感染早期均低于正常水平；TLR4和TLR8的mRNA均在感染后3、12和36h表達(dá)上調(diào)，TLR10分別在在3h和36h表達(dá)上調(diào)，其他時(shí)段均不同程度的降低；而TLR2和TLR9mRNA表達(dá)水平在感染后24h開始升高，并于48h達(dá)到峰值，

5、分別為空白水平的10.1倍和26.7倍。表明PPV感染PK-15細(xì)胞后能夠誘導(dǎo)細(xì)胞上TLR2和TLR9在mRNA水平顯著上調(diào)。
　　2.為研究PPV感染PK-15對(duì)NF-κB信號(hào)通路和免疫應(yīng)答的影響，通過熒光定量PCR方法檢測(cè)PPV感染PK-15細(xì)胞后MyD88、TRAF6和NF-κB等通路相關(guān)因子及炎性細(xì)胞因子IL-6在mRNA水平的表達(dá)情況，同時(shí)利用ELISA方法檢測(cè)PPV感染后炎性細(xì)胞因子IL-6的變化規(guī)律。結(jié)果顯示，PPV

6、感染PK-15細(xì)胞后通路相關(guān)因子MyD88、IRAK1、TRAF6、TAK1α、IκBKB和NF-κB在感染后期表達(dá)量顯著升高；IL-6的mRNA和蛋白表達(dá)均在感染后36h達(dá)到峰值。以上結(jié)果表明PPV感染PK-15細(xì)胞后激活了NF-κB信號(hào)通路，并引起炎性因子的表達(dá)。
　　3.為進(jìn)一步研究TLR9在TLRs-NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)中的作用，本研究利用TLR9抑制劑E6446二鹽酸鹽來研究TLR9在PPV感染PK-15

7、細(xì)胞激活NF-κB信號(hào)通路中的作用。結(jié)果顯示0.02μM和0.03μM E6446二鹽酸鹽能夠特異性抑制TLR9的表達(dá)，并引起IL-6的表達(dá)量下調(diào)；對(duì)不同時(shí)間段細(xì)胞分泌IL-6濃度研究顯示，E6446二鹽酸鹽處理的細(xì)胞IL-6的表達(dá)量在48h達(dá)到峰值，而PPV感染組細(xì)胞內(nèi)IL-6的分泌在24h達(dá)到峰值。
　　本研究發(fā)現(xiàn)PPV感染PK-15細(xì)胞后能夠被TLR9識(shí)別，通過MyD88依賴途徑激活NF-κB，并調(diào)控炎性細(xì)胞因子IL-6的表