放線菌JY-22抑菌機理及抑菌物質(zhì)初步分離.pdf

1、自2007年本實驗室對縉云山土壤拮抗放線菌資源進行調(diào)查研究，篩選獲得一株拮抗效果顯著的放線菌株JY-22，鑒定為鏈霉菌屬吸水鏈霉菌Streptomyces hygroscopicus。實驗室前期工作優(yōu)化了該菌發(fā)酵條件，并明確JY-22菌株的發(fā)酵液對溫度與紫外具有很好的穩(wěn)定性，在80℃水浴3h后，紫外照射30 min后均不會對菌株JY-22發(fā)酵濾液抑菌活性造成影響。對真菌病原菌抑菌譜廣，抑菌率達41.9％~75.7%。因此，有必要進一步研

2、究JY-22抑菌機理和代謝活性產(chǎn)物特性，本文以煙草赤星病菌(Alternaria alternata)為靶菌，初步明確放線菌JY-22的活性代謝產(chǎn)物抑菌機理及其活性產(chǎn)物的分離純化工藝為進一步研究提供依據(jù)。結論如下：1.JY-22對煙草赤星病的作用機理
　　為明確吸水鏈霉菌JY-22的活性產(chǎn)物對煙草赤星病菌的抑菌機理，為后續(xù)產(chǎn)品開發(fā)應用提供依據(jù)。將10塊培養(yǎng)4 d的煙草赤星病菌菌餅加入100 mL PD培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)36 h后加

3、入無菌發(fā)酵濾液，使其濃度分別為10%、5%、2.5%、1%、0%，24 h后采用電導率法測對細胞膜滲透性影響，96 h后采用菌絲濕重法和紫外吸收法測對菌絲生長，可溶性蛋白，麥角甾醇及丙二醛含量的影響。結果表明，JY-22對煙草赤星病菌具有拮抗作用，菌絲尖端出現(xiàn)膨大畸形、菌絲內(nèi)原生質(zhì)體外滲、細胞質(zhì)凝聚出現(xiàn)囊狀膨大物；JY-22無菌發(fā)酵濾液處理后，10%無菌濾液對菌絲抑制率達到75%，電導率增大電解質(zhì)外漏，丙二醛含量顯著升高，麥角甾醇與可溶

4、性蛋白含量降低。表明放線菌JY-22對煙草赤星病菌具有顯著拮抗作用，主要通過抑制麥角甾醇合成，引發(fā)細胞膜脂質(zhì)過氧化，使細胞膜受損，導致菌絲生長受損。細胞膜是JY-22主要作用方式之一。
　　2.JY-22活性物質(zhì)的分離
　　通過Doskochulova紙層析、Betina溶劑系統(tǒng)紙層析及pH紙層析初步確定JY-22的活性類型，通過對JY-22無菌發(fā)酵濾液的處理和分離純化確定JY-22活性物質(zhì)的分離方法。結果表明，JY-22活

5、性物質(zhì)可能為一種新的酸堿兩性多烯類，極性較大的生物堿；JY-22發(fā)酵濾液依次經(jīng)過乙醇沉淀，石油醚脫脂，正丁醇萃取，大孔樹脂吸附（水和乙醇洗脫）、硅膠柱層析（氯仿:甲醇:濃氨水=8:2:0.2）、SephadexLH-20柱層析二次（水甲醇洗脫）、制備高效液相分離（甲醇和含0.05%濃氨水的水洗脫）可獲得JY-22主要活性產(chǎn)物。
　　3.JY-22活性產(chǎn)物藥效試驗
　　以煙草赤星病菌為靶菌，通過皿內(nèi)抑菌圈法明確了JY-22正丁

6、醇萃取物藥效；通過JY-22正丁醇萃取物與吡唑醚菌酯(25%)復配確定其與農(nóng)藥是否具有增效作用。試驗結果表明，JY-22正丁醇萃取物皿內(nèi)藥效試驗抑菌濃度 EC50為35.68 mg/L， EC90為408.08 mg/L。與作用方式不同的吡唑醚菌酯(25%)復配，V(吡唑醚菌酯4 mg/L):V(JY-22正丁醇粗提物125 mg/L)=1:6時，以EC90值評價具有增效作用，吡唑醚菌酯使用量為1.21 mg/L，相比單獨使用吡唑醚菌酯