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1、人類胚胎干細(xì)胞(hESCs)是來(lái)源于著床前囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)能在長(zhǎng)期培養(yǎng)中無(wú)限增殖并保持未分化狀態(tài),且具有分化成人體組織各種細(xì)胞類型能力的細(xì)胞。hESCs能為細(xì)胞移植治療提供細(xì)胞來(lái)源,也可作為研究個(gè)體發(fā)生發(fā)育的工具。近來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道每株hESCs都有自己獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄模式,并且在增殖時(shí)間、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、長(zhǎng)期培養(yǎng)中的穩(wěn)定性、自發(fā)分化模式及X失活狀態(tài)等方面均可能存在很大差異。本研究中,通過(guò)流式檢測(cè)、基因表達(dá)和集落培養(yǎng)等方法分別比較了在自發(fā)分化和造血誘導(dǎo)分
2、化條件下本實(shí)驗(yàn)室建立的四株hESCs系(chHES-8,XY,chHES-22,XY,chHES-32,孤雌,chHES-137,XX)向造血分化的能力,以篩選出具有較大造血分化潛能的hESCs,進(jìn)行后續(xù)的造血分化研究。 第一部分 比較四株hESCs系造血分化潛能。 目的:比較在自發(fā)分化和誘導(dǎo)分化的條件下四株hESCs系(chHES-8,chHES-22,chHES-137,chHES-32)向造血分化的潛能。
3、方法: 1、EB自發(fā)分化12天,消化成單細(xì)胞懸液后,流式檢測(cè)KDR、CD34和CD45陽(yáng)性率;RT-PCR檢測(cè)GATA-1、GATA-2、SCL和Runxl的表達(dá)水平;造血集落培養(yǎng); 2、EB誘導(dǎo)分化12天,消化成單細(xì)胞懸液后,流式檢測(cè)glycophorin-A、CD34和CD45陽(yáng)性率;RT-PCR檢測(cè)GATA-1、GATA-2、SCL和Runxl的表達(dá)水平: 3、將誘導(dǎo)分化12天的EBs,轉(zhuǎn)至用Matrige
4、l包被的12孔板貼壁培養(yǎng)7天,用胰酶消化后收集黏附和非黏附的細(xì)胞接種于MethoCultSFH4436半固體造血集落培養(yǎng)基中做造血集落培養(yǎng)。 結(jié)果:chHES-22向造血分化的潛能最大。 第二部分 hESCs向成血成血管細(xì)胞誘導(dǎo)分化的初步研究。 目的:誘導(dǎo)chHES-22向成血成血管細(xì)胞分化。 方法:收集在ModifiedTeSRTM1培養(yǎng)的未分化的hESCs克隆,在含50ng/mlBMP-4和50ng/
5、mlVEGF的STEMPR0-34SFM培養(yǎng)。3.5天時(shí),消化EBs成單細(xì)胞懸液,接種在在含多種細(xì)胞因子的半固體培養(yǎng)基(BGM)中培養(yǎng)原始集落形成細(xì)胞。 結(jié)果:chHES-22在BGM培養(yǎng)體系中可形成葡萄串樣的原始細(xì)胞集落,每4×104個(gè)EB來(lái)源的細(xì)胞可形成26個(gè)集落。 總結(jié): 1、通過(guò)流式檢測(cè)、基因表達(dá)和集落培養(yǎng)等方法比較了在自發(fā)分化和造血誘導(dǎo)分化條件下四株hESCs系向造血分化的潛能,篩選出具有較大造血分化潛
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